[发明专利]一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法

说明书

本发明涉及一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法，具体顺序为配制乳铁蛋白溶液，然后与单糖在特定条件下糖基化，获得两种糖基化产物比乳铁蛋白促成骨细胞增殖活性分别提高15.7%和11.3%，抑制细胞凋亡分别提高3.1%和1.2%、碱性磷酸酶分泌分别提高23.2%和20.1%，细胞周期中分别延长G2/M期73.2%和63.3%、S期68.3%和72.1%，缩短G1/G0期分别12.3%和12.0%，使JNK蛋白磷酸化水平表达分别提高‑37.5%和28.8%、使ERK1/2蛋白磷酸化水平的表达提高100.9%和66.0%、使p38蛋白磷酸化水平的表达提高2.7%和74.3%，可以有效地提高牛乳铁蛋白抑制骨质疏松功能。该制备方法只需一步操作就可以完成，条件容易控制、适合产业化，修饰后的糖基化产物溶解性良好。经鉴定这两种糖基化蛋白在Lys47、Lys329和Lys627有共同的结合位点。

技术领域

本发明属于食品蛋白改性技术领域，本发明涉及一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法。该方法获得的产物具有显著的抑制骨质疏松活性，并且其中一种产物使细胞增殖途径与天然人乳铁蛋白的途径一致。。

背景技术

对于婴儿而言，母乳蛋白是最为理想的，但是由于多种原因只能用牛乳或其他动物乳来替代母乳喂养。乳铁蛋白是乳中具有多功效性的糖蛋白，其生物学性质包括预防骨质疏松、抗微生物性、抗炎性、抗癌性、免疫调节性和酶活性等，目前乳铁蛋白被广泛应用于保健食品、配方奶粉、医药等领域中，但资源有限，因此提高乳铁蛋白生物学活性是缓解乳铁蛋白供需矛盾的有效途径。本发明通过糖基化获得和人乳铁蛋白相同作用途径的牛乳铁蛋白糖基化产物，旨在提高牛乳铁蛋白的促成骨细胞增殖活性，达到预防骨质疏松的作用。

增加乳铁蛋白活性，提高其利用效率，从而降低对乳铁蛋白的需求量受到广泛关注。目前，有一篇文献认为，乳铁蛋白的糖基化修饰可以提高其抗氧化性，另一篇则是报道了糖基化修饰后的乳铁蛋白其消化性有所改变。

利用糖基化技术来获得具有高活性抑制骨质疏松的乳铁蛋白糖基化产物、同时其增殖途径与天然人乳铁蛋白一致已经成为一个新的方向。如何稳定提高活性、研究结构与活性之间的关系是本领域急需解决的技术问题。

发明内容

发明目的：提供一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法，获得具有高活性抑制骨质疏松的乳铁蛋白糖基化产物。

技术问题：本发明通过糖基化牛乳铁蛋白技术，获得的产物和天然人乳铁蛋白具有相同的促进骨细胞增殖作用途径，提高了其抑制骨质疏松的活性。

技术方案：一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法，该方法工艺简单、易于操作、提高抑制骨质疏松的活性、具有和天然人乳铁蛋白相同的作用途径，按照以下步骤进行：

（1）乳铁蛋白糖基化的制备：将一定量的牛乳铁蛋白用去离子水溶解，按照质量比1:1-1:10的比例加入葡萄糖、果糖或半乳糖，充分溶解后，将该溶液置于水浴锅中，于40-90℃反应12-80 h，反应结束后将溶液置于-30-20℃的环境中10-40 min；

（2）糖基化产物预处理：用分子量为5-50 kDa的透析袋，体积为3-5 L的去离子水透析48-96 h。根据BCA试剂盒测定的结果，将糖基化产物的浓度调整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm滤膜除菌备用；

（3）糖基化产物对成骨细胞增殖作用：将100 μL浓度为1×10⁴-1×10⁶个/mL的成骨细胞溶液于96孔板中过夜培养，加入不同的糖基化产物进行检测，两种糖基化产物比未修饰的乳铁蛋白显著地促成功细胞增殖，二者的通路分别与天然牛乳铁蛋白和天然人乳铁蛋白一致。