[发明专利]一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法

权利要求书

1.一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：

S1：溶液的配制：配制标准固定液、PI溶液、NaOH溶液、饱和水合氯醛溶液、过碘酸溶液、NaHSO3-HCl混合溶液、低熔点琼脂糖凝胶溶液；

S2：植物种子的固定：将成熟的植物种子置于装有标准固定液的离心管中，将含有标准固定液和种子的离心管放至真空泵中固定，再经过酒精逐级脱水，得到固定脱水后的植物种子样本；

S3：植物种子脂质的去除：将步骤S2中处理好的植物种子取出并置于装有石油醚的离心管中，于室温条件下轻轻搅拌，弃去石油醚后，加入丙酮浸泡，弃去丙酮后，加入氯仿浸泡，得到去脂质的植物种子；

S4：植物种子中蛋白的去除：首先将步骤S3中去脂质后的样品经再水化处理；在体视镜下将种皮去除并转移至NaOH溶液中萃取；随后将去除种皮种子的胚在蒸馏水中漂洗；然后在饱和水合氯醛水溶液中浸泡；弃去水合氯醛溶液，用蒸馏水冲洗，以去除残留的透明剂，最终得到透明完全的种子胚；

S5：透明种子胚的染色：将透明后的种子胚加入过碘酸溶液醛化后，采用蒸馏水清洗；加入NaHSO3-HCl溶液和PI溶液共染后，弃去染液；最后用蒸馏水清洗样品；得到颜色呈粉红色的染色样品；

S6：样品包埋与成像：本步骤使用光片层荧光显微镜对待测样品进行成像；首先打开所述显微镜、激光开关、计算机及其控制软件；将加热低熔点琼脂糖至其完全溶解，将待检测样品浸于其中，使用合适直径的玻璃毛细管吸入待测样品及低熔点琼脂糖；待低熔点琼脂糖凝固后，然后打开样品室，将样品垂直固定于样品槽中并关闭舱门；然后调整所述显微镜使得窗口确保样品清晰且位于镜头中央位置；最后进行扫描成像，待扫描结束后，通过拼接软件进行不同扫描区域原始图像的拼接，得到二维荧光图像；

S7：数据分析：利用ImageJ软件对单张二维图像进行细胞参数测量，并利用测量结果对细胞参数进行统计分析；利用Imaris软件对成像后植物胚结构的荧光二维图像进行三维重构及数据，最终得到一套完整的包含原始种子所有三维信息的立体模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准固定液的配制：取37-40％(m/v)的福尔马林、冰醋酸、65％-70％(v/v)乙醇和甘油按5：5：90：5的体积比例倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液；所述PI溶液的配制：称取5mg PI粉末，溶于5ml蒸馏水中，利用锡纸包好并-20℃储存；所述NaOH溶液的配制：称取4g NaOH固体颗粒，溶于100mL蒸馏水中，得到4％(w/v)NaOH溶液；所述饱和水合氯醛溶液的配制：称取水合氯醛50g，分别加入15mL和10mL的双蒸水和甘油使其溶解，获得饱和的水合氯醛试液；所述过碘酸溶液的配制：称取过碘酸0.5g，加50mL蒸馏水使其溶解，获得1％过碘酸溶液；所述NaHSO3-HCl混合溶液的配制：称取1g亚硫酸氢钠NaHSO3溶于10mL 1mol/L盐酸中，获得NaHSO3-HCl混合溶液；所述低熔点琼脂糖凝胶溶液的配制，称取1g低熔点琼脂糖，加入蒸馏水100mL并加热至沸腾使其溶解，然后分装至1.5mL离心管中，获得1％琼脂糖凝胶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S2中，植物种子的固定：将成熟的植物种子置于装有1mL标准固定液的1.5mL离心管中，将含有标准固定液和种子的离心管放至真空泵中在18-20kpa的压力下固定2h，正常大气压力下于4℃储存1d后，再经过70％至100％(v/v)酒精逐级脱水，得到固定脱水后的植物种子样本。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中，植物种子脂质的去除：将步骤S2中处理好的植物种子取出并置于装有1mL石油醚的离心管中，于室温条件下轻轻搅拌48h；弃去石油醚后，加入1mL丙酮浸泡6h；弃去丙酮后，加入1mL氯仿浸泡6h，得到去脂质的植物种子。