[发明专利]一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法

说明书

本发明公开了一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法，该方法包括以下步骤：S1：溶液的配制；S2：植物种子的固定；S3：植物种子脂质的去除；S4：植物种子中蛋白的去除；S5：透明种子胚的染色；S6：样品包埋与成像；S7：数据分析。该方法实施简单方便，成本低廉；使用此发明方法后，种子透明度显著提升，染色效果理想，提升了激发光穿透样品的能力的同时，均匀染色后的样品被完整激发，不仅大幅提高了扫描效率，且成像结果十分清晰。此方法的开发十分利于大体积植物种子三维成像及其结构的重构，也为植物种子内部参数计算提供可靠数据。

技术领域

本发明属于生物学领域，具体涉及一种能够快速实现对杨树种子透明染色及其三维成像方法的领域。

技术背景

生命体的物质与能量代谢等生命活动和器官内部形态发生与结构变化之间存在互相依赖的关系。细胞在行使不同功能过程中并不全是细胞自主性行为，而是通过细胞关联和协同作用的结果。因此，多细胞器官通过不同种类细胞间相互作用赋予系统更高阶的功能。此外，细胞与细胞、细胞与组织乃至组织与组织之间的相互交流和互做逐渐成为目前分子细胞生物学的研究热点，在植物生长发育和优良品种改良方面发挥指导作用。种子内部不同组织状态以及各组织内部细胞的排布结构及动态变化与其休眠、萌发和逆境发育等多种生命活动息息相关。近年来，越来越多的研究热点集中于种子内部结构与其相关功能的关联分析。作为植物生长过程的最初阶段，种子在形态结构上表现出十分稳定的遗传特性，为进一步探索不同种子在品种、发育阶段或遗传改造之间的细微差异提供了研究基础。然而，应用现有成像技术(譬如光学、荧光、共聚焦显微镜以及常规切片技术) 对于种子体内组织结构和细胞形态分布分析具有很大的局限性，无法快速简便地获取整体种子形态与内部组成的高分辨、高质量和三维尺度等信息。因此，寻找合适的透明技术和成像方法，对种子内部细胞大小、排布与形态等参数进行深入解析，对了解植物种子的生理学特征和发育过程具有重要的指导意义。

光片层荧光显微镜(Light Sheet Fluorescence Microscopy,LSFM)是一种利用片层荧光对样品进行光学切片并实现亚细胞水平成像的技术。与传统共聚焦显微镜(LaserScanning Confocal Microscopy,LSCM)相比，其含有多个激发光光源以及多个成像物镜，具有多视角、成像快速和低光毒性等优点，成为大尺寸活体样本研究的有效工具之一。由于LSFM技术需要片层激发光穿过样品进行成像，因此待测样品需要具有较高的透明度。植物本身及其内部由不同光学性质的各种物质组成。当激发光穿过植物组织时，光的分布和强度分别因为光散射和光吸收而出现不同程度的变宽和衰减，导致成像图案模糊和弱化，尤其是在组织中深层区域。因此，样品组织的透明度的高低决定着LSFM成像质量。组织透明化可使光散射和吸收最小化，从而改善成像深度和对比度，从而提升成像质量。植物样品透明化后的染色是LSFM成像的关键步骤之一，染色不足导致信噪比低，而染色过度则可能阻碍激发光的路径导致部分信号丢失。因此，不同植物样品染色条件的建立决定着最终成像的质量。然而，已报道的透明及染色技术无法满足 LSFM对植物种子高质量成像的需求，因此开发一种适用于植物种子的透明染色及其成像方法对于种子结构、功能及其发育研究提供技术支持，也为植物不同组织、器官甚至整体三维成像的应用提供理论依据。

发明内容

本发明的目的是为了克服种子透明度不高以及染色条件不足的问题，开发一种基于LSFM成像技术对植物种子透明、染色及多尺度细胞水平成像的方法。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种纯化原核表达融合His标签蛋白的方法，包括以下步骤：