[发明专利]ant(3″)-Ia基因的LAMP试剂盒及其专用引物

说明书

本发明公开了用于检测ant(3″)‑Ia基因的LAMP试剂盒及其专用引物。用于对ant(3″)‑Ia基因进行LAMP检测的引物是根据ant(3″)‑Ia基因特异性的保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、尿液、粪便样品中的ant(3″)‑Ia基因。所述用于对ant(3″)‑Ia基因进行LAMP检测的六条引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到ant(3″)‑Ia基因，不需要复杂仪器，最低检测极限均可达100fg/μL，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

技术领域

本发明涉及分子检测领域，属于细菌耐药基因检测技术，特别涉及用于检测ant(3″)-Ia基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

ant(3″)-Ia基因(aminoglycoside-3″-adenyltransferase)又名aadA，aadA1，aad(3″)(9)，首次于1985年被hollingshead和vapnek报道。普遍存在于肠杆菌科，鲍曼氏杆菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌等革兰氏阴性细菌中，是一种最常见的一种氨基糖苷类抗生素的耐药基因。其作用机制是利用ATP作为第二底物，通过将AMP转移到3″位羟基，从而使抗生素与核糖体结合不紧密，导致抗生素不能进入下一阶段发挥抗菌作用，使细菌在抗生素存在的情况下仍能存活。主要修饰的氨基糖苷类抗生素为大观霉素和链霉素。在细菌的DNA中，ant(3″)-Ia基因常常通常以基因盒的形式存在，是大量整合子、质粒和转座子的一部分。它们或者常被发现与其他抗性酶融合，例如插入IS26；或者是众多转座子的一部分，如：广泛传播的tn21和其他被称为tn21亚家族的相关转座子、TN1331、含有2类整合子的TN7。

自氨基糖苷类抗生素问世以来，以其优良的抗菌活性、谱广性和较长时间的抗生素后效应得到临床的亲睐，但是近年来由于抗生素不合理使用，越来越多的细菌产生了耐药性，甚至是多重耐药性，给临床治疗带来了新的问题。对铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等革兰氏阴性细菌进行耐药基因的调查，其中常能发现ant(3″)-Ia基因。彭敬红(彭敬红，侯彦强，谢多双，刘军，郑蓉，铜绿假单胞菌16S rRNA甲基化酶基因和氨基糖苷修饰酶基因的研究，检验医学[J]，2015，30(6)：613-616)对十堰市某三甲医院临床分离的35株氨基糖苷类耐药的铜绿假单胞菌进的基因检测，发现ant(3″)-Ia的基因阳性率为51.4％(18株)。张凡(张凡，郭普，张伦军，郑晶，郑照军，徐元宏，铜绿假单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药基因检测，安徽医科大学学报[J]，2018，53(6)：928-932)对蚌埠医学院第一附属医院于2016年1～12月临床分离的248株铜绿假单胞菌进行了耐药基因检测，发现有54株为氨基糖类抗生素耐药菌株，其中ant(3″)-Ia的基因阳性率为66.7％(36株)。卓启芳(卓启芳，耐氨基糖普类抗菌药物的鲍曼不动杆菌氨基糖普酶和16S r RNA甲基化酶基因的检测[D]，天津医科大学，天津医科大学，2013)对天津医科大学第二医院呼吸科2010年1月-2011年12月临床分离的136株鲍曼不动杆菌共进行了耐药基因的检测，发现有32株为氨基糖苷类抗生素耐药菌株，其中ant(3″)-Ia的基因阳性率为90.6％(29株)。沙代提古力·米吉(沙代提古力·米吉提，乌鲁木齐地区鲍曼不动杆菌耐药分析及氨基糖苷类修饰酶基因型的研究[D]，新疆医科大学，新疆医科大学，2018)对乌鲁木齐地区734鲍曼不动杆菌进行氨基糖苷类耐药基因检测，发现有35株氨基糖苷类耐药菌株，其中ant(3″)-Ia的基因阳性率为100％。

现有的检测方法，一般只是通过药敏实验来判定微生物是否对某一种抗生素具有耐药性，该法费时，操作繁琐。