[发明专利]一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法

权利要求书

1.一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

（1）Helper修饰磁珠：取2 µL 10 mg/mL链霉亲和素磁珠于1.5 mL的EP管中，加50µL 1xBW清洗液混匀，借助外加磁场的作用，将上清液吸走，重复洗3次；最后加20 µL PBS-T缓冲液重悬，制成浓度为1 mg/mL的链霉亲和素磁珠，室温放置备用；取2 µL 1 mg/mL 制备好的链霉亲和素磁珠于1.5 mL的EP管中，再加入20 µL 0.1 µMDNA Helper，25℃孵育40 min后，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，清洗去多余的未结合上的Helper，获得Helper修饰磁珠；

（2）黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B1适配体混合物的制备：先往1.5 mL的EP管中各加入20 µL 0.1 µM 黄曲霉毒素B1适配体，再加入5µL一定浓度的黄曲霉毒素B1溶液，25℃孵育1h，得到黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B1适配体混合物；

（3）DNA的杂交：将（2）中得到的黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B1适配体混合物转移到（1）的Helper修饰磁珠EP管中，再加入25 µL PBS-T缓冲液，在25℃孵育1 h，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次；

（4）滚环扩增反应：往步骤（3）的EP管中加入5µL 2x Quick Ligation Buffer和4 µL 1µM 环形DNA，25℃孵育30min后，加入 1 µL 350 U/µL 的T4 DNA连接酶，25℃孵育5 min，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次；再加入2 µL10x Phi 29 Buffer，2 µL10 mM 的 dNTP，14.5 µL超纯水，0.5 µL 100x BSA和1 µL 10 U/µL Phi 29 DNA聚合酶，30℃孵育3 h；借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，再加入24 µL PBS-T和2.5 µL 100 µM 信号DNA，25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，再加48µL PBS-T缓冲液，2µL 0.02 mg/mL辣根过氧化物酶，25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用200 µL PBS-T缓冲液清洗5次，再加入200 µL TMB/H₂O₂显色底液进行显色观察；

步骤（1）中所述Helper的核苷酸序列为：5′-ACACGTGCCCAACTTTTTT- biotin - 3′；

步骤（2）中所述黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列为：5′- GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC- biotin - 3′；

步骤（4）中所述环形DNA 的序列为：5'-PO₄-CACGTGTTCATATAAGTTGGTACCGCAGTATGAGTATCTCCTATGAGTACTAAGTGGAAGAAATCATGG-3′；所述信号DNA的序列为：5′-AAGTGGAAGAAAT-biotin - 3′。

2.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步骤（2）中所述黄曲霉毒素B1溶液的浓度为：0~100µM。

3.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：所述方法中所述 BW清洗液的组成为：5 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，1 M NaCl，0.05 % Tween-20；所述PBS-T缓冲液的组成为：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，0.05 % Tween-20。