[发明专利]一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法

说明书

本发明公开了一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，属于分析化学及生物技术领域。该方法包括Helper修饰磁珠、AFTB1和AFTB1适配体混合物的制备、DNA的杂交、滚环扩增反应四个步骤。利用磁珠在外磁场作用下易于收集和分离的优点，以及生物素与链霉亲和素之间专一、迅速和稳定结合的特点，将生物素修饰的辅助DNA连接在链霉亲和素磁珠上，后加入到AFTB1和足量AFTB1适配体的混合物中，当AFTB1存在时，通过滚环扩增反应，反应液显蓝色，从而实现对AFTB1黄曲霉毒素B1的快速可视化检测。

技术领域

本发明属于分析化学及生物技术领域，具体涉及一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法。

背景技术

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。主要是由黄曲霉（Aspergillus flavus)和寄生曲霉 （Aspergillusparasiticus）产生的次生代谢产物。在天然条件下，它至少产生13种黄曲霉毒素，其中，黄曲霉毒素B1（AFTB1）分布最广，含量最高，毒性最强。1993年被世界卫生组织（WHO）列为I类致癌物。体内黄曲霉素含量在1 mg/kg的水平以上就可诱发癌症，其主要引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。许多国家和国际组织已对AFTB1在食品中的限量标准做出了严格的规定。目前检测黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法（TLC）、超高效液相色谱法（UHPLC）、酶联免疫分析法（ELISA）、免疫亲和柱-荧光光度计联用法、免疫亲和柱-HPLC法、免疫亲和柱-HPLC-串联质谱法等。

TLC 法是早期测定AFTB1的主要方法，其优点在于所用设备简单、费用低廉，属于定性和半定量检测。但TLC法在检测AFTB1过程中需要使用有毒试剂，灵敏度较低，现已逐渐被其它方法所取代。

酶联免疫分析法（ELISA）是筛查AFTB1的重要方法，其基本原理是基于抗原抗体之间的特异性反应，先将AFTB1抗体包被到某一固相载体上，再按一定的程序加入AFTB1样品/标准品和AFTB1-HRP（AFTB1酶标记物）后，样品/标准品中的AFTB1和AFTB1-HRP竞争性结合固相载体上的AFTB1抗体，最后再加入HRP酶反应底物——TMB溶液进行显色。ELISA法虽然特异性强，灵敏度也较高，但是干扰因素多，特别容易受到温度和时间的影响，重现性不好；容易受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，容易出现结果失真、假阳性。

免疫亲和柱-HPLC分析法和免疫亲和柱-荧光光度计联用检测法同样是基于抗原抗体之间的反应来实现对AFTB1的检测方法，随着这两种方法的日渐成熟，逐渐成为了检测AFTB1的主流方法。这两种方法都是利用免疫亲和柱基于抗原抗体之间的反应对样品进行前处理后，再进行HPLC或者使用荧光分光光度计检测AFTB1的含量。虽然准确、灵敏，但却无法实现现场快速检测，都要进行比较繁杂的样品前处理，操作复杂、耗时；而且需要使用到大量的有机试剂，容易对环境造成污染；同时需要用到的试剂和材料比较多，导致成本较高。

无论是ELISA还是免疫亲和柱-荧光分光光度计联用检测法，或者是免疫亲和柱-HPLC分析法，都面临着免疫分析众所周知的缺陷：（1）抗体的制备需要免疫动物，操作复杂，过程周期较长，需要专门的技术人员，成本较高。（2）因制备过程的个性化，抗体的结合能力存在批次间差异。（3）抗体需要低温储藏、保质期较短。这些不足都在一定程度上限制了免疫分析法在现场快速检测中的应用。