[发明专利]一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体及其构建方法与用途

说明书

本发明公开了一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体及其构建方法与用途，属于基因工程技术领域。本发明中的信号肽突变体是将来源于革兰氏阳性菌Sec途径的信号肽N区的带电荷氨基酸进行定点突变，使N区氨基酸的电荷密度为0.2～0.8之间；对所述信号肽H区进行突变，使H区的氨基酸疏水性在0～70之间；对所述信号肽C区的氨基酸进行定点突变，使C区最后三位氨基酸突变为丙氨酸‑任意氨基酸‑丙氨酸。本发明可以有效提高异源蛋白在微生物宿主中的分泌量，有效推动了目的蛋白的高效表达及工业化生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体及其构建方法与用途。

背景技术

工业酶和生物制药蛋白等重组蛋白具有非常广阔的应用市场。目前人们已经研究出多种原核和真核表达系统来生产重组蛋白。其中，细菌具有容易处理、基因操作工具多等优点，更多地被用来当作重组蛋白的表达宿主。然而，异源蛋白在宿主中的表达往往会形成不溶性的包涵体，且容易被蛋白酶降解，这些都使得异源蛋白难以规模化生产。而将重组蛋白分泌到细菌宿主的生长介质中，则可以有效防止重组蛋白在胞浆中形成不溶性包涵体。另外，重组蛋白的分泌可以减轻该蛋白对生产宿主的毒性作用，可以简化产品下游处理步骤，显著降低生产成本。因此在生产过程中，人们希望能够将重组蛋白高效地分泌到细菌表达宿主的培养上清液中。

信号肽(signal peptide，缩写为SP)是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，多数位于分泌蛋白的N末端，其长度通常为16～30个氨基酸残基。信号肽包含三个区域：N区、H区和C区。N区由1～5个带正电荷的氨基酸残基组成，与带负电荷的磷脂相互作用。信号肽的中间部分是H区，由7～15个疏水性氨基酸残基构成。C区长度通常是3～7个氨基酸，主要包括能被信号肽酶识别并切割的亲水性氨基酸。在异源蛋白的分泌过程中，信号肽的性质对异源蛋白的分泌量起着关键的作用。

发明内容

本发明提供了一种利用定点突变对信号肽进行改造，从而提高异源蛋白在细菌宿主中的分泌量的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体，所述突变体是将来源于革兰氏阳性菌的Sec途径的信号肽N区的带电荷氨基酸进行定点突变，使N区氨基酸的电荷密度为0.2～0.8；对所述信号肽H区进行突变，使H区的氨基酸疏水性为0～70；对所述信号肽C区的氨基酸进行定点突变，使C区最后三位氨基酸突变为丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸。本发明可以有效提高异源蛋白在微生物宿主中的分泌量。

其中，信号肽N区电荷密度的计算方法为：氨基酸R、K所带电荷量为+1，氨基酸D、E所带电荷量为-1，其余氨基酸所带电荷量为0。N区氨基酸的电荷总数除以N区氨基酸总个数所得值为N区电荷密度。

其中，信号肽H区氨基酸疏水性计算采用Kyte-Doolittle方法，氨基酸对应的疏水值如下表：

表1不同氨基酸对应的疏水值

优选地，对所述信号肽H区进行突变，使H区的氨基酸疏水性为0-38。

更优选地，对所述信号肽H区进行突变，使H区的氨基酸疏水性为20-38。

优选地，对所述信号肽N区的带电荷氨基酸进行定点突变，使N区氨基酸的电荷密度为0.25-0.45。

优选地，所述信号肽来源于枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，来源于解淀粉芽孢杆菌。

优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，来源于枯草芽孢杆菌。