[发明专利]一种分子尺发夹结构及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法

说明书

本发明涉及一种分子尺发夹结构及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法，首先构建茎干部分含有多个CCGG位点的发夹结构为分子尺发夹结构，将发夹结构固定于工作池表面，使用单分子磁镊实时监测磁珠的位置，计算可以得到分子尺发夹结构于两个相邻停顿态之间的精确长度，亦即相邻CCGG位点间长度。通过长度与碱基对数的转换，可以精确计算长度转换系数，并与蠕虫模型理论值进行比较，从而衡量单分子磁镊空间尺度的准确度。本发明可用于精密仪器准确度的标定，拓宽了衡量精密仪器准确度的方法。

技术领域

本发明属于精密仪器测量与分析领域，尤其是涉及一种通过使用DNA长度变化来标定单分子磁镊仪器空间尺度准确性的方法。

背景技术

单分子力谱技术是近年来生物物理领域新兴的精密测量与分析技术，可以在体外或细胞内检测单个分子或分子复合物的动态反应过程。单分子磁镊是流行的单分子力谱技术之一，可对成百上千的单个分子施加外力和扭矩，并进行平行追踪。生物分子的长度及长度变化是单分子磁镊测量的重要指标，可用来计算一系列蛋白质—核酸作用的具体参数。但是单分子磁镊仪器的准确度目前依赖于通过虚焦影像分析，对微球探针进行空间定位。

构建磁镊空间尺度准确性的标准测量方法，需要分子长度理论计算、原子精度分子结构和动态测量分子构象变化等技术。蠕虫模型可计算出DNA在特定缓冲液条件下的单链和双链长度，提供分子长度变化的理论值。锌指结构CXXC家族蛋白识别DNA上的特异位点，形成稳定的蛋白-核酸复合物，已被晶体学方法解析出原子细节的结构。譬如，十-十一易位双加氧酶1(TET1)的CXXC结构域与含CCGG位点的DNA形成稳定的复合体。磁镊通过解链双链DNA，破坏在特异位点上形成的蛋白-核酸复合体，可测量复合体的位置信号，获得DNA长度变化。目前没有衡量单分子磁镊空间尺度准确性的标准方法。

中国专利CN201910380148.5公开了一种单分子磁镊检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法，精密测量了CXXC蛋白与DNA的结合事件。到目前为止，基于蛋白-核酸复合体结合事件和理论模型衡量单分子磁镊空间尺度准确性的方法未见报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种分子尺发夹结构及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法。

本发明采用的技术方案是：一种测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构，茎干部分含有多个CCGG位点。

优选地，CCGG位点数量包括2-20个，各个CCGG位点等距设置；

优选地，相邻两个CCGG位点之间由AT序列隔开，AT序列长度为16-40bp；

优选地，AT序列长度为18bp。

优选地，还包括生物素把手、地高辛把手、第一核酸片段、第二核酸片段、Y字结构、loop结构和组成茎干部分的第三核酸片段和第四核酸片段；

第一核酸片段连接生物素把手和Y字结构，第二核酸片段连接地高辛把手和Y字结构，茎干部分连接loop结构和Y字结构。

优选地，第三核酸片段由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10退火形成，第四核酸片段由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12退火形成。

测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构的制备方法，包括如下步骤：

PCR获得生物素把手及地高辛把手，并对制得的生物素把手及地高辛把手进行酶切；

退火反应制备Y字结构、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构，并进行磷酸化；

将制得的生物素把手、地高辛把手、Y字结构、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构连接得到分子尺发夹结构。