[发明专利]一种新型红细胞膜单抗生产方法及其加工装置

权利要求书

1.一种新型红细胞膜单抗的生产方法，其特征在于，所述新型红细胞膜单抗的生产方法包括以下步骤：

步骤一，将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，得到的液体中每毫升添加0.04ml 10％硫酸葡聚糖和1ml 1M氯化钙，搅拌15分钟，10000rPm离心10分钟后收集上清，得到样品；

步骤二，将筛板置于层析柱底部，排出柱底和管子内的气体后，填装ProteinA填料，使放柱和填装的速度一致；用纯化水洗涤5-10倍柱体积，利用淋洗装置进行淋洗以去除乙醇，进行柱准备；

步骤三，用平衡缓冲液10mM pH8.3的Tris-NaCl淋洗5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出，蛋白紫外检测仪显示值为0；步骤二中的Protein A长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8℃保存；

步骤四，在稀释装置内利用两倍体积pH8.3的平衡缓冲液Tris-NaCl进行稀释后，作为样品上样，调节生产控制系统的蠕动泵控制模块中的蠕动泵转速4滴/秒，使用蠕动泵在20-25℃条件下上样；将填料上方的平衡液排出，直至液面和上筛板相切时停止；

所述步骤四后，还需进行：

(1)加入10-15倍柱体积的洗杂缓冲液，开启蠕动泵进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液；

(2)平衡完成后使用高浓度的氯化钠进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白；

(3)解离完成后用0.1M pH2.7的甘氨酸缓冲液进行再生2倍柱体积；再生完成后用平衡缓冲液10mM pH8.0的Tris-HCl平衡柱5-10倍柱体积；

(4)将得到的含蛋白组分的溶液置于1-3倍去离子水中，搅拌均匀后使用2-5KDa的透析膜、pH7-8的10-30mM磷酸盐缓冲溶液在4℃条件下进行透析处理48-72h；所述磷酸盐缓冲溶液的用量为 含蛋白溶液的10-20倍，换液3次，每次透析时间不低于4小时；

(5)透析完成后回收抗体并置于抗体孵育盒中进行孵育；孵育完成后用等电点沉淀制备抗体纳米粒子并用红细胞膜包裹抗体纳米粒子，用0.2μm滤膜过滤后添加0.09％NaN₃，置于4℃进行蛋白保存。

2.如权利要求1所述新型红细胞膜单抗的生产方法，其特征在于，步骤四中，(3)所述的解离方法为：首先往样品中添加高浓度的氯化钠，置于50～70℃作用5～20min，再添加解离剂对抗原抗体复合物进行解离；所述解离剂中含有5～6M的尿素、3.0～7.0％的Tween 80、0.5～3.0％的Triton X100；所述解离剂中尿素的含量为5.5M，所述Tween 80的含量为5％，所述Triton X100的含量为1.0％；所述高浓度的氯化钠浓度为1.5～3M。

3.如权利要求1所述新型红细胞膜单抗的生产方法，其特征在于，步骤四中，(5)所述抗体纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

1)制备红细胞膜：将大鼠血转移至含肝素钠的EP管中；全血离心，弃去上层清液，留下暗红色沉淀，PBS洗涤，离心机离心，再洗涤数次；弃去上层清液，留下沉淀，取PBS吹散，取0.2mMEDTA放入离心管混匀，充分溶血后，加入20*PBS，离心，再溶血离心数次；弃去上层清液，沉淀物为红细胞膜；

2)等电点沉淀制备抗体纳米粒子：将抗体装入透析袋，在超纯水中透析，收集透析袋中的抗体，冻干，-20℃保存；取冻干抗体，溶于含Tween80的HCl溶液中，在磁子搅拌下逐滴加入NaOH溶液，直至烟雾样沉淀至最大量；离心，小心移除上清，得到抗体纳米粒子；所述Tween80浓度为0.01％-5％，HCl浓度为0.005M-0.5M，NaOH浓度为0.005M-0.5M；

3)制备红细胞膜包裹的抗体纳米粒子：将红细胞膜与抗体纳米粒子混合，加入1*PBS重悬，超声下加入20*PBS使PBS终浓度至1*PBS，既得红细胞膜包裹的抗体纳米粒子；所述红细胞膜包裹的抗体纳米粒子粒径为50nm-500nm。