[发明专利]一种新型红细胞膜单抗生产方法及其加工装置

说明书

本发明属于生物医学技术领域，公开了一种新型红细胞膜单抗生产方法，进行腹水溶解、过滤、加硫酸葡聚糖和氯化钙离心，淋洗，平衡，稀释，清洗，解离，透析，孵育，制备抗体纳米粒子并用红细胞膜包裹、过滤并保存等步骤。本发明的生产方法操作简单且过程易控制，产出率高；本发明生产的新型红细胞膜单抗灵敏度高，特异性高，结果容易判定；还具有高稳定性、高癌细胞摄取率、低网状内皮系统清除率，及明显延长体内循环作用时间的特点；本发明的加工装置能够基于预设流程进行生产方法的精准控制，提高了生产效率，减少了生产操作的复杂性，提高经济效益，并且能够实现智能化控制，减少了人工投入。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种新型红细胞膜单抗生产方法及其加工装置。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：与传统小分子抗癌药相比，由于具有高特异性和强亲和力，抗体正日益成为最重要的抗癌药物之一。与其相比，尽管小分子抗癌药有一定的药效，并目前在化疗中仍然使用广泛，但其仍存在非特异性毒性(因针对所有分化细胞)和治疗窗小等缺点。另外，小分子抗癌药的耐药性也是其临床使用中常出现的问题，这些缺点给化疗病人带来了很多痛苦。而抗体因其对非特异性细胞毒性低、人体免疫原性低、生物可降解和生物相容性好等优点，已经越来越受到重视。

随着对不同类型癌细胞异常信号通路的研究进一步发展，肿瘤标志物中许多关键的调节因子也逐渐成为了分子靶向治疗的靶点。但由于抗体难以穿透细胞膜进入细胞内部，导致目前发现的许多细胞内的有效靶点如TERT、磷酸酶/激酶转录因子等不能用抗体阻断，很大程度上阻碍了针对细胞内部抗原的抗体的成药性。游离抗体的体积过大影响了其穿透肿瘤的能力，高间隙压阻止了大分子在肿瘤中的扩散，这些因素进一步影响了肿瘤细胞对抗体药物的摄取，成为阻碍治疗进展的关键问题之一。抗体作用的靶点分为细胞内和细胞外，人们通常将注意放到细胞外靶点上以获得更高的抗体-抗原接触机会，而对细胞内靶点的药物研究少之又少。实际上，胞内靶点是一个巨大的资源，因为他们既有更高的特异性，在与抗体接触后又有很高的杀伤率。但目前极少人尝试以细胞内抗原为靶点探讨抗体纳米粒子的摄取和作用。

另一方面，抗体是一种不稳定的蛋白，其暴露在外部的结构很容易受外界环境影响而失活，因此许多抗体在静脉注射后体内滞留时间短，这也阻碍了抗体药物的发展和应用。为了增加抗体半衰期，人们做了很多努力。如PEG化已经成为增加循环时间的金标准，但同时也存在一些问题，如产物纯度不够、对修饰分子的选择性高、可能增加药物毒性、大分子PEG排出体外困难等等。对于如何增加抗体循环时间仍需要有更深入的研究。

再则，一定粒径的外源性粒子在体内易被网状内皮系统识别并清除，这在一定程度上大大减少了大分子药物在体内的作用时间。粒子的粒径、表面电荷等对于这一问题都有着很大的影响。而红细胞膜身为体内内源性物质，由于其表面携带一些特定蛋白如CD47，可以帮助其逃脱网状内皮系统的吞噬。我们可以利用红细胞膜这一特点，给大分子药物穿上“外衣”，以降低巨噬细胞吞噬，延长体内作用时间。

现有专利CN201811323290.8红细胞膜单抗及其制备方法，包括步骤1：准备试剂：平衡缓冲液、解离缓冲液、再生缓冲液、透析缓冲液、pH中和液；准备设备：Protein A柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵；步骤2：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清；填装适量Protein A填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，淋洗去除乙醇；步骤3：进行平衡、上样、再平衡、解离、再生、再平衡、透析、回收，保存Protein A柱，清洗蠕动泵进样管；步骤4：配制试剂：10mMTris-NaCl、0.1M柠檬酸、0.1M甘氨酸缓冲液、20mM Tris-NaCl、2M Tris、透析缓冲液。此过程操作复杂，制备条件难以控制，产出率低。