[发明专利]一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法在审
| 申请号： | 202010080886.0 | 申请日： | 2020-02-05 |
| 公开（公告）号： | CN111321142A | 公开（公告）日： | 2020-06-23 |
| 发明（设计）人： | 翁炳焕;李兰娟 | 申请（专利权）人： | 翁炳焕 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/861;C12N5/10;A61K39/215;A61P31/14 |
| 代理公司： | 北京轻创知识产权代理有限公司 11212 | 代理人： | 孟鹏超 |
| 地址： | 310000 浙江省杭州市上*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 新型 冠状病毒 肺炎 dsrna 疫苗 制备 方法 | ||
1.一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，扩增nCoV2019的靶向干扰基因shRNA序列，所得产物与空干扰载体pSilencer经BamH I和Hind III酶切而构建干扰载体pSilencer-shRNA，该干扰载体pSilencer-shRNA经感受态大肠杆菌DH5a扩增和shRNA插入正确性鉴定后，用HindlII和EcoRI酶切pSilencer-shRNA和空穿梭载体pDC312，构建穿梭载体pDC312-shRNA，使穿梭载体pDC312-shRNA与腺病毒骨架质粒pBHGloxAEl共转染HEK293细胞，在胞内同源重组而获得重组腺病毒Ad-shRNA，再经HEK293细胞多次扩增和纯化制备Ad-nCoV dsRNA疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述靶向干扰基因shRNA序列指长度为19nt的与siRNA序列互补的RNA序列。
3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述靶向干扰基因shRNA序列为表达发夹结构的模板，由两条大部分互补的单链DNA构成，经退火互补后能形成带有BamH I和Hind III酶切位点粘性末端的DNA双链。
4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述Ad-nCoVdsRNA疫苗接种后，重组腺病毒载体Ad将shRNA导入细胞，的shRNA能在细胞内合成dsRNA，所合成的dsRNA能特异性降解具有同源序列的nCoV mRNA。
5.根据权利要求4所述的一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述Ad-nCoVdsRNA疫苗通过喷雾接种，重组腺病毒载体Ad将shRNA导入呼吸道上皮细胞并在细胞内合成dsRNA，继之特异性诱导同源的nCoV mRNA降解，产生抗nCoV2019的转录后基因沉默或RNA干扰。
6.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述nCoV2019指新型冠状病毒的保守基因或功能基因序列；所述保守基因或功能基因序列包括ORF1ab、3'UTR、S、E、M、N基因序列。
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