[发明专利]一种新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于医学领域的新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，扩增nCoV2019的靶向干扰基因shRNA序列，所得产物与空干扰载体pSilencer经BamH I和Hind III酶切而构建干扰载体pSilencer‑shRNA，该干扰载体经感受态大肠杆菌DH5a扩增和shRNA插入正确性鉴定后，用Hind lII和EcoR I同时酶切pSilencer‑shRNA和空穿梭载体pDC312，构建穿梭载体pDC312‑shRNA，使其与腺病毒骨架质粒pBHGloxAEl共转染HEK293细胞，在胞内同源重组而获得重组腺病毒Ad‑shRNA，再经HEK293细胞多次扩增和纯化制备nCoV dsRNA疫苗，通过喷雾接种，重组腺病毒载体Ad将shRNA导入呼吸道上皮细胞并在细胞内合成dsRNA，继之特异性诱导同源的nCoV mRNA降解，产生抗nCoV2019的转录后基因沉默或RNA干扰。

技术领域

本发明涉及一种用于传染病防治领域的新型冠状病毒肺炎dsRNA疫苗的制备方法，属于疫苗制备方法技术领域。

背景技术

人类冠状病毒(HcoV 229E和HcoV OC43)可引起达30％的感冒。动物冠状病毒，如猪胃肠炎冠状病毒(TGEV)、小鼠肝炎冠状病毒(MHV)、鸟传染性气管炎冠状病毒(IBV)等可感染相应宿主的呼吸道、胃肠道、神经系统和肝脏，导致相应症状。冠状病毒的包膜呈花瓣形突起，使冠状病毒看起来像王冠(拉丁语，corona)，其核衣壳是可变的长螺旋形。冠状病毒的病毒粒子直径为60nm～140nm，球形，病毒基因组是27kb～32kb的单链正义RNA，是所有RNA病毒基因组中最大的。2003年冠状病毒的一个变种引起了严重急性呼吸综合征即非典(SARS)的爆发，SARS-CoV基因组大小为27～3lkb，有14个开放读码框(open readingframe， ORF)和1个s2m模序(s2m motif)。

石正丽等报道从5名病人体内获得了基本一致的nCoV-2019全基因组，其中有79.5％的序列与SARS-CoV一致，通过对其保守的7个非结构蛋白进行对比，发现nCoV-2019属于 SARSr-CoV的包膜RNA病毒。nCoV-2019含有5'非翻译区(UTR)、复制酶复合体(orf1ab)、S 基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR以及几个未知的非结构性开放式阅读框架。对于nCoV-2019 的基因诊断(PCR)，目前中国疾病预防控制中心推荐了针对新型冠状病毒nCoV-2019的开放读码框1ab(ORF1ab)、核壳蛋白(nucleoprotein，N)基因区域的引物和探针序列，其中：Target 1(ORF1ab)：正向引物(F)：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物(R)：为ACGATTGTGCATCAGCTGA；探针(P)： 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。Target 2(N)：正向引物 (F)：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物(R)：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；荧光探针(P)：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'。nCoV-2019全基因组序列和功能的分析(A Novel Coronavirus from Patients with Pneumoniain China,2019.The New England Journal of Medicine,2020,January 24)也为nCoV-2019的进一步研究奠定了良好的基础，但目前尚缺少有关nCoV-2019的更确切信息。