[发明专利]一种快速检测猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒的多重荧光RDA方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测猪病毒的探针，其特征在于，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1-6任一所示，其中核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4的探针用于检测猪伪狂犬病毒(PRV)，核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5的探针用于检测猪圆环病毒(PCV)，核苷酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6的探针用于检测猪细小病毒(PPV)。

2.如权利要求1所述的检测猪病毒的探针，其特征在于，所述探针核苷酸序列如下：SEQID NO.1或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6。

3.如权利要求2所述的检测猪病毒的探针，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ IDNO.1-3所示的探针，其5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。

4.如权利要求2所述的检测猪病毒探针，其特征在于，所述的SEQ ID NO.4探针5’端起第33位碱基T标记FAM发光基团，第34位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第35位碱基标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰；所述的SEQ ID NO.5探针5’端起第33位碱基T标记CY5发光基团，第34位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第35位碱基标记BHQ2淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰；所述的SEQ ID NO.6探针5’端起第30位碱基T标记ROX发光基团，第32位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第34位碱基标记BHQ2淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰。

5.一组用于检测伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒的靶标序列、引物对及探针，其特征在于，所述探针为权利要求2-4任一所述的探针，所述引物对核苷酸序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，所述靶标序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示。

6.一种多重检测猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及权利要求2-4任一所述的探针及权利要求5所述的引物对。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的恒温扩增反应模块为RDA或RPA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂；所述RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的重组酶KX。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂包括重组酶KX 60-600 ng/μL、KY蛋白16-192 ng/μL、单链结合蛋白gp32 100-1000ng/μL、链置换DNA聚合酶3-100 ng/μL、逆转录酶200U、核酸外切酶30~200U、肌酸激酶0.1-0.8 mg/ml、磷酸肌酸25-75 mM、Tris缓冲液20~100mM、PEG 2.5%-10%、醋酸钾或醋酸钠0-150 mM、dATP 1-5 mM、dNTPs 150-600 nM、DTT 1-12 mM、所述探针150nM-600nM、所述引物对150-600nM。

9. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的核酸提取试剂包括Buffer A、Buffer B；所述Buffer A为样本裂解液，含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、SDS、EDTA、异硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；所述Buffer B含有Tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁；所述阳性对照为含有猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因、猪圆环病毒(PCV) ORF2基因、猪细小病毒(PPV)NS1基因的pUC57-X质粒，所述阴性对照为空载体pUC57质粒。

10.一种非疾病诊断目的检测伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

提取待测样品的核酸，以待测样品的核酸为模板，在伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒的引物对、探针及RDA冻干粉试剂、Buffer A和Buffer B存在下进行实时荧光RDA反应，根据实时荧光RDA扩增曲线分析待测样品；其中所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示; 其中反应温度为25-42℃，反应时间大于10分钟。