[发明专利]一种快速检测猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒的多重荧光RDA方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种快速检测猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物组以及RDA荧光标记探针，以实现对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒的安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。本发明中提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，在恒温条件下20min内实现对三种病毒的检测，特异性为100％，与普通PCR方法相比，RDA荧光法在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短，适用于现场快速检测。本发明的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，可为猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于多重RDA荧光法检测技术检测猪伪狂犬病毒(PRV) 核酸、猪圆环病毒(PCV) 核酸、猪细小病毒(PPV)核酸的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)是引起猪多系统疾病的常见病原，经常混合感染，诊断和防治比较困难，是危害养猪业最为严重的几种病原，是世界各国的重点防控疫病，也是我国养猪场检疫净化的主要对象。目前，针对上述几种猪病病原建立了多种分子检测技术，如PCR和荧光PCR技术等，在这些疫病的诊断和防控中发挥了重要作用。然而目前分子生物学的检测大多基于PCR，检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，需配备专门的PCR实验室和专业操作人员，其成本和应用范围均受到一定限制。随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）等均可在等温条件下扩增核酸模板。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的 PCR 仪的依赖。若能在更低的温度条件下，甚至在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。

及时准确地发现传染病疫情对于疾病的防治和疫情的控制具有重要意义，因此研究和开发一种能在常温下多重特异性检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV) 、猪细小病毒(PPV)的试剂盒非常有必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒检测技术的缺陷和不足，提供了一种能同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV) 、猪细小病毒(PPV)三种核酸的多重RDA荧光法检测试剂盒，实现对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV) 、猪细小病毒(PPV)的快速检测。本发明在检测PRV、PCV、PPV的整个过程中，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，大大缩短了常规的检测时间，提高检测效率。

本发明目的在于，提供优选后的用于检测猪病毒的探针，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1-6任一所示，其中核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4的探针用于检测猪伪狂犬病毒(PRV)，核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5的探针用于检测猪圆环病毒(PCV)，核苷酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6的探针用于检测猪细小病毒(PPV)。

本发明另一个目的在于，提供优选后的同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV) 、猪细小病毒(PPV)的靶标序列、引物对及探针。

所述检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV) 、猪细小病毒(PPV)的探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示。