[发明专利]一种快速检测犬冠状病毒（CCV）的RDA方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测犬冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及探针及引物对，所述探针核苷酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示，引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述靶标序列如SEQ ID NO.5所示，所述的恒温扩增反应模块为RDA或RPA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂；所述RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的重组酶KX和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的辅助蛋白KY。

2.如权利要求1所述的检测犬冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的探针为5’-FAM-TCACT[THF]AGTGCTATTACCAACAGCTTATGA-BHQ1-3′或者

5’-CCAAACGGCATGGTTTTCTTTCACTCAGTGC[FAM-dT]A[THF][BHQ1-dT]ACCAACAGCTTATGA[C3-spacer]-3。

3.如权利要求1所述的检测犬冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂为重组酶KX60-600ng/μL、KY蛋白16-192ng/μL、单链结合蛋白gp32100-1000ng/μL、链置换DNA聚合酶3-100ng/μL、反转录酶200U、核酸外切酶30～200U、肌酸激酶0.1-0.8mg/ml、磷酸肌酸25-75mM、Tris缓冲液20～100mM、聚乙二醇2.5％-10％、醋酸钾或醋酸钠0-150mM、dATP1-5mM、dNTPs150-600nM、二硫苏糖醇1-12mM、权利要求1所述的探针150nM-600nM、权利要求1所述的引物对150-600nM。

4.如权利要求1所述的检测犬冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的核酸提取试剂为BufferA和BufferB；所述BufferA为样本裂解液，组成为Tris-HCL缓冲体系、NaOH、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、异硫氰酸胍、Tween80和曲拉通；所述BufferB为Tris缓冲体系、氯化钾和氯化镁；所述阳性对照为含有犬冠状病毒靶标基因的质粒，所述阴性对照为空载体pUC57质粒。

5.如权利要求1所述的试剂盒在制备检测犬冠状病毒产品中的应用，其特征在于，所述的应用包含以下步骤：

提取待测样品的核酸，以待测样品的核酸为模板，在犬冠状病毒的引物对、探针及RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂、BufferA和BufferB存在下进行实时荧光RDA反应，根据实时荧光RDA扩增曲线分析待测样品；其中所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示；其中反应温度为25-42℃，反应时间大于10分钟。

6.如权利要求5所述的试剂盒在制备检测犬冠状病毒产品中的应用，其特征在于，所述反应温度为39℃，所述反应时间为30分钟。