[发明专利]一种快速检测犬冠状病毒（CCV）的RDA方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种快速检测犬冠状病毒（canine coronavirus，CCV）的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对犬冠状病毒（CCV）的安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。本发明中提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，在恒温条件下20min内实现犬冠状病毒（CCV）的检测，特异性为100％，与普通PCR方法相比，RDA荧光法在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短，适用于现场快速检测。本发明的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，可为犬冠状病毒（CCV）现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于RDA荧光法检测技术检测犬冠状病毒（canine coronavirus，CCV）核酸的引物对、探针及相关试剂盒。

背景技术

犬冠状病毒（Canine coronavirus，CCV）是引起犬急性胃肠炎的重要病原之一。该病呈世界性分布,我国很多地区也有流行, 给养犬业造成了严重损失。近年来国外开展了大量的CCV分子生物学研究工作, 对其蛋白组成和基因组结构进行了详细论述。为了解CCV在我国的分子流行病学特点，阐明其基因特征，为本病的防治提供理论依据和分子生物学检测方法，本发明以临床收集的CCV为研究对象，建立了CCV (RT -RDA)检测方法。

分子生物学的检测大多基于PCR，检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，需配备专门的PCR实验室和专业操作人员，其成本和应用范围均受到一定限制。随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）等均可在等温条件下扩增DNA。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的PCR仪的依赖。若能在更低的温度条件下，甚至在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有犬冠状病毒检测技术的缺陷和不足。研究得到一种犬冠状病毒（CCV）RDA荧光法检测试剂盒，实现犬冠状病毒（CCV）的快速检测，在检测CCV的整个过程中，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，大大缩短了常规的检测时间，提高检测效率。该技术可结合便携式的样本处理技术，不依赖于实验室设备，可采样现场进行检测，对犬冠状病毒感染等疾病控制具有重要意义。

本发明目的在于，提供优选后的检测犬冠状病毒的探针及引物对。

所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。

优选地，采用两种方案设计RDA荧光标记探针，第一种方案为：在靶标区域选择25-35bp保守序列为探针序列，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30个位于 THF 位点的 5’端，另外至少 15 个位于其 3’端。通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于RDA荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异。

所述核苷酸序列为SEQ ID NO .1的探针，其5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代，其具体信息如下：

CCV-P1（SEQ ID NO .1）：

5’-FAM-TCACT[THF]AGTGCTATTACCAACAGCTTATGA-BHQ1 -3′；