[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法

权利要求书

1.一株猪繁殖与呼吸综合征病毒，保藏编号为CCTCC NO：V 202020，分类命名为porcine reproductive and respiratory syndrome virus Gxnn1396-P96。

2.权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体，其特征在于为该病毒基因组全长感染性克隆pGXAM。

3.根据权利要求2所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体，其特征在于该克隆载体中Gxnn1396-P96基因组14402核苷酸处产生一个沉默突变C-G突变，形成了MluⅠ酶切位点。

4.权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体在制备重组病毒或基因工程疫苗方面的应用。

5.权利要求3所述克隆载体的构建方法，其特征在于：从Gxnn1396-P96病毒感染的细胞培养物中提取病毒RNA，通过反转录获得第一链cDNA；以第一链cDNA为模板，用4对引物扩增出4个覆盖全基因组的cDNA片段，克隆到Zero TOPO载体中，得到4个克隆质粒，分别命名为PRRSV-A、PRRSV-B、PRRSV-C和PRRSV-D；用限制性内切酶酶切四个克隆质粒，纯化回收目的片段，逐步替换到具有同样酶切位点的质粒pJX143中；用JX14402MluⅠF和PR15300引物在Gxnn1396-P96基因组14402核苷酸处产生了一个沉默突变C-G突变，所得片段经Mlu I和Not I酶切后连接到类似的酶切质粒pJX143中，得到Gxnn1396-P96株PRRSV的全长cDNA克隆pGXAM。

6.应用权利要求1所述克隆载体插入基因的方法，其特征在于：以ORF4和ORF5a之间作为外源基因插入位点，插入一种或者多种基因。

7.根据权利要求6所述的插入基因的方法，其特征在于：用序列表SEQ.NO.ID.10-14所示序列作为引物进行PCR扩增，在ORF4和ORF5a之间通过融合PCR的方法引入酶切位点BstbⅠ和SbfⅠ以及TRS序列，得到ORF4和ORF5a之间插入外源基因的PRRSV重组质粒pGX45BSTRS；所述外源基因为绿色荧光基因GFP，用序列表SEQ.NO.ID.15-16所示序列作为引物扩增得到后，用BstbⅠ和SbfⅠ限制性内切酶酶切后，连入同样酶切的重组质粒pGX45BSTRS，得到重组质粒pGX45BSTRS-GFP。

8.根据权利要求7所述的插入基因的方法，其特征在于所述PRRSV重组质粒pGX45BSTRS按以下操作制备：以pGXAM感染性克隆为模板，用正向引物GF11706和反向引物45BSR扩增出一个上游片段，该片段含有BstB I和sbf I限制性内切酶位点，用正向引物45BSF和反向引物JX14402Mlu I R扩增出一个下游片段，该引物含有BstBⅠ和SbfI限制性内切酶位点；将得到的上下游片段作为第二轮融合PCR的模板，用正向引物GF11706和反向引物JX14402Mlu IR进行PCR扩增，获得的PCR产物克隆到ZeroTOPO载体中，得到中间质粒pTOPO-45BS；以质粒pTOPO-45BS为模板，用含有Sbf I限制性内切酶位点和TRS序列的正向引物SbfI-TRS和反向引物JX14402Mlu I R扩增出一个片段，并用限制性内切酶SbfI和Mlu I酶切该含有SbfI和TRS的片段，将其连接到用Sbf I和Mlu I酶切过的pGXAM中，获得可以在ORF4和ORF5a之间表达外源基因的PRRSV重组感染性克隆pGX45BSTRS。

9.根据权利要求7所述的插入基因的方法，其特征在于所述重组质粒pGX45BSTRS-GFP按以下操作制备：扩增具有BstB I和Sbf I两个酶切位点的绿色荧光基因GFP，将其酶切产物连接到同样酶切后的pGX45BSTRS中，获得在ORF4和ORF5a之间插入GFP的PRRSV重组感染性克隆pGX45BSTRS-GFP。