[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法

说明书

本发明公开了一株猪繁殖与呼吸综合征病毒，其保藏编号为CCTCC NO：V 202020。据此，发明人构建了该病毒基因组全长感染性克隆pGXAM并建立相应构建方法和插入基因的方法。该载体是以Gxnn1396‑P96为母本，通过分子生物学的手段，构建PRRSV全长感染性克隆载体，在cDNA克隆的基础上，在ORF4和ORF5a中插入一个独立的转录调控序列(TRS)，构建了一种表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的PRRSV重组病毒。该荧光标记病毒的成功构建，为研制重组猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明属于猪繁殖与呼吸综合征病毒技术领域，尤其涉及一株猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus， PRRSV)是威胁世界养猪业的重要传染病病原之一，引起的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)为高度接触传染性疾病，主要引起母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等严重的繁殖障碍和仔猪呼吸障碍、生长停滞、高死亡率等临床表现。PRRSV给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。

PRRSV是动脉炎病毒家族的成员，是一种单链RNA病毒，其基因组长度约为15.4kb，包括至少由九个开放阅读框编码的病毒的复制酶多蛋白和八个结构蛋白。PRRSV基因组的5′端约2/3区域编码两种多聚蛋白(pp1a和pp1ab)，经病毒蛋白酶处理后形成成熟的非结构蛋白(nsps)，Nsps在病毒复制和转录中起关键作用。PRRSV基因组的3′端约1/3区域编码7个病毒结构蛋白。结构蛋白由一系列的3′-5′共末端、嵌套的亚基因组(sg) mRNAs翻译而来。转录调控序列(TRS)在合成sg mRNA的过程中起关键作用。。TRS包含6 个核苷酸核心序列，每侧由15-20个核苷酸组成，有助于调节结构蛋白sg mRNA的产生。这八种结构蛋白包括糖蛋白5(GP5)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)、2b、GP2、GP3、GP4 和ORF5a，它们在产生感染性子代病毒方面都具有重要的功能。

PRRSV感染性cDNA克隆可作为潜在的病毒载体。Nsp2是PRRSV中变化最大的非结构蛋白。在nsp2的高变区(HVR)常见有氨基酸的自然缺失和插入。将nsp2的HVR中病毒复制非必须的免疫优势表位进行缺失并插入外源基因，可开发出一种新的可区分感染和接种动物的标记PRRSV疫苗(DIVA)。然而，在MARC-145细胞中连续传代后，大多这些重组病毒中插入的外源基因遗传不稳定。另一种表达外源基因的策略是通过插入额外的独立转录单元来产生额外的sg mRNA来表达外源基因。但是，PRRSV采用严格控制的基因表达策略，除了ORF1b和ORF2、ORF4和ORF5a、ORF7和3′UTR外，大多数编码结构蛋白的ORF 之间存在重叠区域。在重叠序列之间插入外源基因会引起相邻的编码区域一些氨基酸突变，使突变克隆难以获得拯救。目前，在ORF1与2或ORF7与3′UTR之间插入外源基因的重组克隆，已经成功获得多个表达外源基因的重组病毒，其策略是将外源基因插入ORF1 与2或ORF7与3′UTR之间，在外源基因下游插入TRS，ORF1b和ORF2a或ORF7和3′UTR 上游的TRS负责外源基因的转录，插入的TRS调节下游病毒基因sg mRNA的产生。利用该策略，成功获得表达外源基因的重组PRRSV，包括标记基因、猪病毒免疫原基因和细胞因子基因，拯救的重组病毒在细胞和体内传代过程中证明了外源基因的稳定性和生物活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和在 ORF4和ORF5a之间插入外源基因方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：