[发明专利]用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量PCR引物和参考标准品

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断与治疗为目的的H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系的鉴别方法，其特征在于：

(1)针对H1N1亚型流感病毒的4个遗传进化谱系，即古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系，分别筛选出可以用于遗传进化谱系鉴别、只具有谱系内特异性，而无谱系间交叉反应的4对PCR鉴别引物；各谱系鉴别引物的序列如下；

1)古典猪流感病毒谱系

上游引物：5′-CARCAMATCCTAYATTAATG-3′，下游引物：5′-ATTTTCCAATTGTGATCGG-3′

2)季节性人流感病毒谱系

上游引物：5′-YACTGATTTCYAAGGAR-3′，下游引物：5′-GGTACRARCCATTC-3′

3)禽流感病毒谱系

上游引物：5′-AGTTGGGTCATCGAAG-3′，下游引物：5′-CTAGATTGAATRGAAGGA-3′

4)欧亚类禽猪流感病毒谱系

上游引物：5′-GCCTGAATGGAAAGAK-3′，下游引物：5′-GWAGATTGCYTTTCAAG-3′

各引物所处区域分别位于某一遗传进化谱系HA基因核苷酸序列的相对保守区，且该区域的核苷酸序列与其他遗传进化谱系HA基因的核苷酸序列存在明显差异，同时保证绝大多数差异位点位于所设计引物的3’端，以降低非特异性PCR扩增出现的概率；

(2)该4对引物可以利用荧光定量PCR方法对H1N1亚型流感病毒的4个遗传进化谱系进行特异性鉴别，具体如下：

1)根据H1N1亚型流感病毒HA基因遗传进化树的分析结果，从4个遗传进化谱系中各选取一株病毒的HA全长基因序列，其GenBank注册号分别为：MK159413、V01088、CY077076、KM028031，送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并与pEASY-T1 Simple载体连接；将4个遗传进化谱系HA基因的重组质粒分别命名为pEASY-T1-I、pEASY-T1-II、pEASY-T1-III、pEASY-T1-IV，以此作为荧光定量PCR方法的标准品；

2)所述的荧光定量PCR方法包括如下步骤：

①荧光定量PCR方法的反应体系：

在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10μL，ddH₂O 8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，待鉴定毒株的cDNA 0.25μL，至终体积20μL；

②荧光定量PCR方法的反应条件：

将步骤①的反应体系置于荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件：第一阶段，95℃，2min；第二阶段，95℃，15s；47℃，30s；40个循环；

③荧光定量PCR标准曲线的构建：

将步骤1)中所构建的标准品稀释成5个不同的拷贝数，分别为10¹⁰copies/μL、10⁸copies/μL、10⁶copies/μL、10⁴copies/μL、10²copies/μL；将步骤2)①反应体系中的“待鉴定毒株的cDNA”分别替换为5个不同拷贝数的标准品，反应条件同步骤2)②；以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线；不同拷贝数标准品测得的Ct值呈现良好的线性关系，标准曲线相关系数R²≥0.90，且5个不同拷贝数质粒所对应的Ct值≤35；

④结果判定标准：

a.阳性结果：当待鉴定毒株cDNA的Ct值≤35，Ct值位于4条标准曲线中的其中一条，且出现扩增曲线和峰型单一的熔解曲线，则可以判定该毒株属于扩增该毒株所用鉴别引物对应的遗传进化谱系；

b.阴性结果：阴性结果检测不到Ct值，且无扩增曲线和熔解曲线生成。