[发明专利]用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量PCR引物和参考标准品

说明书

本发明涉及一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法，属于流感病毒鉴别技术领域，其特征在于：包括针对H1N1亚型流感病毒4个遗传进化谱系鉴别引物的设计与筛选，荧光定量PCR鉴别质粒标准品的制备，以及荧光定量PCR方法的建立等步骤。在所建立的荧光定量PCR鉴别方法中，本发明利用4对鉴别引物，以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线，同时检测待鉴定H1N1亚型流感病毒cDNA的Ct值是否处于标准曲线上，从而达到快速鉴别H1N1亚型流感病毒4个遗传进化谱系的目的，以此为H1N1亚型流感病毒的检验检疫、流行病学监测、优势流行谱系的筛查、疫苗种毒的选择等方面提供技术支撑。其简便快速、特异性强、敏感性高。

技术领域

本发明涉及用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量PCR引物和参考标准品，属于流感病毒鉴别技术领域。

背景技术

基于核蛋白和基质蛋白的抗原性差异，目前已经发现甲（A）型、乙（B）型、丙（C）型和丁（D）型等4个血清型的流感病毒，其中以A型流感病毒的流行史最为悠久、波及范围最广、传播能力最强、宿主感染谱最宽、引发的公共卫生威胁最为严重。根据A型流感病毒表面两个纤突蛋白—血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）蛋白的抗原性差异，进一步将A型流感病毒分为不同的血清亚型，迄今已经发现了18种HA亚型和11种NA亚型。其中，H1N1亚型流感病毒在流感流行史上扮演了重要角色，其不仅可以导致人类的季节性和大流行性流感，而且也是引发哺乳动物流感和禽流感的重要病毒亚型。

A型流感病毒编码的HA基因既是病毒抗原性的决定性蛋白，也是划分病毒遗传进化谱系的主要依据。对于H1N1亚型流感病毒而言，其HA基因已经演化出4个不同的遗传进化谱系，分别是古典猪流感病毒谱系（包括人类大流行性流感病毒）、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系和欧亚类禽猪流感病毒谱系。查明H1N1亚型流感病毒的遗传进化谱系，有利于我们判断病毒的来源，明确各谱系病毒在人群和各动物群体中的感染和流行状况，分析各个群体中流行的优势流行谱系，选择与流行谱系抗原性相匹配的疫苗，以及筛选疫苗种毒等。

目前流感病毒的鉴别方法主要包括血清学方法和分子生物学方法。由于A型流感病毒各血清亚型之间存在一定的交叉反应，因此血清学方法不是流感病毒血清亚型鉴别的首选方法。而分子生物学方法，如PCR技术已经广泛应用于临床呼吸道标本、粪便标本和组织脏器标本等样品中流感病毒的检测。在各种PCR方法中，荧光定量PCR方法是美国AppliedBiosystems公司于1996年推出的一种实验技术。该方法利用荧光染料或荧光标记的特异性核酸探针，可以对PCR反应中每一个循环扩增产物的荧光信号进行实时收集，从而实现对起始模板的定性和/或定量分析。由于荧光定量PCR方法具有操作简便、特异性强、敏感性高、准确快速等特点，已经成为流感病毒血清型和血清亚型鉴别的首选方法。

荧光定量PCR方法包括绝对定量和相对定量。其中，绝对荧光定量是应用标准曲线来确定标本的实际拷贝数。其优点在于，可以测定目的基因在样本中的绝对分子数量。构建标准曲线是绝对荧光定量PCR的关键步骤。常用于构建标准曲线的方法是先将目的基因片段克隆到载体中以构建标准质粒，然后测定所构建标准质粒的浓度以计算其拷贝数，再以系列10倍倍比稀释的不同拷贝数的质粒作为模板进行荧光定量PCR，测定不同拷贝数质粒标准品的Ct值。以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线。待鉴定流感毒株的cDNA在进行荧光定量PCR后，根据其Ct值在标准曲线上出现的位置可以计算出样品的浓度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量PCR引物和参考标准品，实现了对H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系进行鉴别的目的，是一种快速、特异、敏感的荧光定量PCR方法，用于鉴别H1N1亚型流感病毒的遗传进化谱系。