[发明专利]一种基于适配体传感器的高灵敏检测血清中PD-L1的方法

权利要求书

1.寡核苷酸序列在制备基于适配体传感器的高灵敏检测血清中PD-L1的试剂盒中的用途，

所述寡核苷酸序列如下所示：

5’端修饰生物素的Apt38，记为Bio-Apt38：

5’-Biotin-AAG ACG GAC CAG CCT TGC CGC AAG ACG GAC CAG GGA TT-3’

扩增模板链3号，记为P3，划线为与Bio-Apt38碱基互补配对部分：

5’-AATCCCTGGTCCGTCTTGCGGCAAGGCTTT GAA TGA GGA GCA GCA CAG AGG TCA GAA CGATGG TCG ACA CAC GAT CAG AAG CTT GGC ATG GAT GAC GAC G-3’

上游引物，记为F1：

5’-AAT CCC TGG TCC GTC TTG CG-3’

下游引物，记为R1：

5’-CGT CGT CAT CCA TGC CAA GC-3’

其特征在于，基于适配体传感器的高灵敏检测血清中PD-L1包括如下步骤：

1)配制下述缓冲液

SELEX结合缓冲液：150mM氯化钠，5mM氯化钾，1mM氯化镁，1mM氯化钙，40mM HEPES，pH7.4；

链霉亲和素磁珠结合/清洗缓冲液BW buff：8mM Tris，1M氯化钠，1mM EDTA，0.02％(V/V)X-100，pH 7.8；

10×反应缓冲液：67mM甘氨酸，6.7mM氯化镁，10mM 2-巯基乙醇，pH 9.5；

2)首先，用生物素标记5'端的Apt38、P3和反向引物R1孵育，通过互补氢键杂交形成核酸复合物；设计了P3的3'端磷酸化和反向引物杂交，以保护互补DNA不被Exo I消化；同时，Apt38的3'端与P3的5'端杂交形成一个钝端，保护Apt38不被Exo I消化；

其次，用Q-PCR方法对同时释放的互补DNA进行扩增和定量；

3)信号双放大传感器构建过程

3.1漩涡混合器混匀链霉亲和素磁珠，转移到微离心管上，并放置在磁分离架上2min，抽吸并清除上清液，随后用BW buff洗涤磁珠2次，每次200μL；取Bio-Apt38、P3、R1混合均匀，95℃水浴5min，0℃冰水浴10min，并在室温下孵育60min，使三条核酸链通过碱基互补配对形成核酸复合物；加入已处理磁珠在22℃下孵育30min，转数80r/min，以形成磁珠-核酸复合物；

3.2磁分离，并用SELEX结合缓冲液洗涤四次每次200μL并重悬；加入10×反应缓冲液、Exo I核酸外切酶及梯度PD-L1蛋白溶液在22℃下孵育60min，转数80r/min；磁分离取上清液，85℃水浴15min；

3.3以表3-1配置Q-PCR体系并以表3-2设置Q-PCR程序，荧光阈值设定为100，检测Ct值随PD-L1蛋白浓度变化的关系，并用Origin8进行数据拟合分析；

表3-1 Q-PCR组成及含量

表3-2 Q-PCR程序

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：

Exo I酶作用浓度为0.05U/μL-0.5U/μL。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：

酶切反应时间为20-120min。