[发明专利]一种基于适配体传感器的高灵敏检测血清中PD-L1的方法

说明书

一种基于适配体传感器的高灵敏检测血清中PD‑L1的方法属于用药辅助诊断领域。目前血清外泌体PD‑L1中的检测是基于抗原抗体杂交的酶联免疫技术，具有检测成本高、操作难度大等缺点。本发明以PD‑L1适配体为例，通过酶切辅助靶循环及Q‑PCR实现检测信号的多重放大，建立了一种PD‑L1超敏检测传感器。本方法可为血清PD‑L1提供更低成本、低操作难度、保持高灵敏性的检测方法。

技术领域

本发明属于用药辅助诊断领域，特别涉及到利用适配体高灵敏检测血清PD-L1的方法。目前血清外泌体PD-L1中的检测是基于抗原抗体杂交的酶联免疫技术，具有检测成本高、操作难度大等缺点。本方法可为血清PD-L1提供更低成本、低操作难度、保持高灵敏性的检测方法。

背景技术

血清中的生物标志物能很好的反映一个人目前所处的身体状况，医生常常通过这些信息运用于疾病的诊断、发展状态、用药辅助等。但血清中成分复杂，直到现在也未能完全研究明白，这给本就极其微量的生物标志物检测带来了极大的难度。

基于单克隆抗体的酶联免疫法是目前运用最广泛的生物标志物检测手段，但其生产与保存成本高、保证批次间一致性困难等阻碍了它的发展。因此，我们提出了一种基于适配体传感器的高灵敏检测血清生物标志物(以程序性细胞死亡配体1为例)的方法，以实现血清样本中生物标志物的高灵敏检测。

适配体的是抗体的良好替代，被誉为“化学抗体”，是指由指数富集的配体系统进化(SELEX)技术产生的单链DNA或RNA小分子，具有生产成本低、抗逆性强、批间一致性好、生产容易等优点。

同时，对程序性细胞死亡配体(PD-L1)检测也具有重大意义。PD-L1是一种I型跨膜蛋白，在多种肿瘤细胞表面均有表达。与活化T细胞表面的程序性细胞死亡受体1(PD-1)相互作用，产生免疫检查点反应。基于这种相互作用，已经开发出多种用于临床治疗人类癌症的免疫检查点抑制剂。然而，只有20-30％的患者观察到临床益处。更严重的是，这类免疫治疗药物可能导致非受益患者产生严重的副作用。因此，迫切需要预后生物标记物来确定哪些患者将在早期治疗中失败，哪些患者将获得持久的疗效。

目前，已经发现了许多生物标记物来预测PD-1/PD-L1抑制剂的治疗效果，如肿瘤进展相关的PD-L1表达水平、错配修复(MMR)状态、肿瘤突变负荷(TMB)等，其中PD-L1是研究最早、最充分的一个。目前，肿瘤细胞表面表达的PD-L1主要通过单克隆抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。然而，从病人身上提取肿瘤组织的要求和单克隆抗体的生产成本在一定程度上使这一策略不能令人满意。最近的研究表明，血液中的外分泌PD-L1可以作为一种潜在的肿瘤生物标记物用于预后评估。因此，检测血液或血清中PD-L1的技术具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于建立一个高灵敏适配体检测传感器，并降低实验成本及操作难度，实现对生物标志物的高灵敏检测。本发明以PD-L1适配体为例，通过酶切辅助靶循环及Q-PCR实现检测信号的多重放大，建立了一种PD-L1超敏检测传感器。利用该传感器，在缓冲体系中，PD-L1的检测限可达0.076ng/mL；在人血清样品中，PD-L1的检测限可达0.3625ng/mL。

上述目的通过以下技术方案实现：

1.合成下述寡核苷酸序列：

5’端修饰生物素的Apt38，记为Bio-Apt38：

5’-Biotin-AAG ACG GAC CAG CCT TGC CGC AAG ACG GAC CAG GGA TT-3’

扩增模板链1号，记为P1，划线为与Bio-Apt38碱基互补配对部分(下同)：