[发明专利]AR-V7荧光qRT-PCR法快速定量检测用引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测AR‑V7及AR的引物及探针，并基于所述引物及探针提供了一种用于检测AR‑V7及AR的试剂盒。该试剂盒包括外泌体抽提试剂、外泌体核酸抽提试剂和AR‑V7的qRT‑PCR法检测试剂。该试剂盒的样本来源广泛、获取容易，外泌体的制备成功率高，外泌体核酸采用自动化抽提，所需操作时间短，操作误差低。同时本发明提供的一步法qRT‑PCR试剂，简化了操作流程，缩短了实验周期，提高了效率，也降低了中间过程样品污染或检测失误的风险。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，特别是涉及及一种人AR-V7荧光qRT-PCR法快速定量检测用引物、探针及试剂盒。

背景技术

前列腺癌是一种常见的恶性肿瘤，并且是造成男性肿瘤死亡的第二大病因。近年来，我国前列腺癌的发病率呈逐年快速上升趋势，2004年为5.8/10万人，到2009年己经上升为8/10万人。由于我国对前列腺癌易感人群的筛查工作相对落后，导致晚期前列腺癌约占初次诊断的前列腺癌的70%，我国初诊为晚期前列腺癌的比例远高于欧美国家（20-30%）。雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy，ADT)是这类前列腺癌患者的最主要治疗方法。尽管在ADT治疗初期前列腺癌被不同程度的控制，但经过一段时间的治疗后，大部分患者的疾病逐渐且不可逆地进展为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistantprostate cancer，CRPC）。

目前已有的药物阿比特龙与蒽杂鲁胺对于CRPC患者的治疗有较好的效果，但仍然有20%-40%的患者PSA维持在较高的水平，却没有明显的疗效，且多数经阿比特龙与蒽杂鲁胺治疗的患者后期几乎都会发生获得性的耐药。关于阿比特龙与蒽杂鲁胺耐药的机制，文献资料显示，雄激素受体信号通路的异常就属于耐药发生的可能机理之一，其中就雄激素受体剪接异构体的产生，又是AR-V7是雄激素受体（AR）研究的比较多的一种截短形式的剪接异构体，AR-V7由于缺少配体结合区，可以不依赖雄激素的结合而对下游的信号通路进行持续的活化，引起细胞的异常增殖。进一步的研究也表明，AR-V7阳性与经阿比特龙与蒽杂鲁胺治疗的CRPC患者的PSA响应率以及存活率呈明显的负相关。因此AR-V7的检测在表征CRPC患者治疗效果方面具有重要意义。

关于AR-V7的检测，目前市场上已有的仅用于科研服务的产品是凯杰公司生产的Adna Test Prostate Cancer Panel，检测的大概流程是：首先采用磁珠法捕获病人的循环肿瘤细胞（CTC），之后进行mRNA的分离提取以及逆转录，最后通过qRT-PCR法完成AR-V7的检测。

采用CTC进行后续AR-V7的检测目前存在许多问题主要有以下几个方面，其一是其对全血样本的新鲜程度要求较高，样本必须在收集数小时内完成CTC的分离；其二是肿瘤细胞高度的异质性，导致CTC的分离只能是获取部分肿瘤细胞，不能够全面的反应患者的疾病状态；其三是CTC在循环系统中的数目较少，5mL全血分离到的CTC可能只有6-7个，甚至完全分离不到。因此，迫切需求开发一种有效、快速、灵敏的AR-V7的检测试剂盒。

发明内容

基于此，本发明通过提取血浆或人尿液中外泌体，再提取外泌体中核酸，之后利用一步法RT-PCR对提取出的外泌体RNA进行对AR-V7以及AR的检测。

本发明第一方面公开了一种用于检测AR-V7及AR的引物，所述引物分别为：

AR-V7 正向引物：CAGGGATGACTCTGGGAGAAA

AR-V7 反向引物：AGTCAGCCTTTCTTCAGGGTC

AR 正向引物：TGCTCAAGACGCTTCTACCAG

AR 反向引物：AGTGAACTGATGCAGCTCTC。

本发明第二方面公开了一种用于检测AR-V7及AR的引物及探针，所述引物及所述探针分别为：