[发明专利]藻红蛋白免疫荧光探针标记方法

说明书

本发明公开了一种藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，该标记方法包括以下步骤：(1)采用胺‑巯基交联剂活化目标蛋白；(2)对藻红蛋白作巯基化处理，获得巯基化的藻红蛋白；(3)将巯基化的藻红蛋白与活化后的目标蛋白交联，获得所述的藻红蛋白免疫荧光探针。本发明的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法中，藻红蛋白无需预先活化，直接对其作巯基化处理，而后与预先活化的目标蛋白交联即可。不仅省略了操作步骤，而且获得的免疫荧光探针在检测时，阳性信号强，背景信号与现有技术相当或较现有技术弱，信噪比高。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种藻红蛋白免疫荧光探针标记方法。

背景技术

藻红蛋白(P-phycoerythrin，简称PE)是从红藻中分离纯化获得的、目前普遍使用的一种新型荧光标记试剂。在特定波长激发下，藻胆蛋白能发射强烈的荧光，其荧光强度是荧光素的30-100倍，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。

将藻红蛋白用于荧光分析，具有传统化学荧光染料无法比拟的优越性。比如：(1)在较宽的pH范围内具有较宽的吸收光谱，比较容易选择合适的激发波长，从而得到高效荧光发射，且激发时有特异的荧光发射峰；(2)吸光度和荧光量子产率很高，荧光强而稳定，灵敏度高；(3)具有较小的荧光背景，不易淬灭，荧光保存期较长；(4)水溶性极佳，易与其他分子交联结合，非特异性吸附少；(5)纯天然海洋生物提取，无任何毒副作用，不含放射性，操作使用非常安全。

现有技术中常常采用PE标记法，将藻红蛋白与抗体、生物素、亲合素、免疫蛋白等物质结合，制成荧光探针。通过检测其发出的荧光，可以用于荧光显微检测、荧光免疫测定、双色或多色荧光分析、癌细胞表面抗原检测、蛋白质和核酸等生物大分子的分析；还可以用于免疫检测、荧光显微技术和流式细胞荧光测定等临床诊断及生物工程技术。

传统的PE标记法(如AnaTag^TM R-PE Labeling Kit)的实施步骤大致是：(1) 将目标蛋白巯基化；(2)采用SMCC对PE进行活化；(3)将巯基化后的目标蛋白与活化后的PE交联。

现有技术中还有一种实施步骤(参见文献：赵亚杰，闭兰，孙可芳，端义坤，詹骞，金玉玲，吕兰君，张爱华.荧光染料R-藻红蛋白标记小鼠抗人CD4 单克隆抗体.微生物学免疫学进展[J].2006，34(2)：32-34.)为：(1)采用SPDP 和SMCC分别活化PE和目标蛋白；(2)将经SPDP活化后的PE巯基化；(3) 将巯基化的PE与经SMCC活化的目标蛋白交联。

无论是哪种PE标记法，在将PE与目标蛋白交联之前，现有技术中都需要活化PE，这就导致在进行荧光检测时，最终获得的目标蛋白PE标记物的阴阳信号信噪比较差，背景信号较强。

为提高标记抗体的阴阳信噪比，正熙生物采用了巯基化PE，SMCC活化抗体的方法，该方法产生的PE标记抗体具有较高的阳性信号值与较强的信噪比。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种操作简便、检测时信噪比高的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法。

为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：

一种藻红蛋白免疫荧光探针标记方法，包括以下步骤：

(1)采用胺-巯基交联剂活化目标蛋白；

(2)对藻红蛋白作巯基化处理，获得巯基化的藻红蛋白；

(3)将巯基化的藻红蛋白与活化后的目标蛋白交联，获得所述的藻红蛋白免疫荧光探针。

本发明的藻红蛋白免疫荧光探针标记方法中，藻红蛋白无需预先活化，直接对其作巯基化处理，而后与预先活化的目标蛋白交联即可。不仅省略了操作步骤，而且获得的免疫荧光探针在检测时，阳性信号较强，背景信号与现有技术相当或较现有技术弱，信噪比高。