[发明专利]基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂及制备方法和应用

权利要求书

1.一种基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：是将编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行表达，纯化，得到的可溶性Flic蛋白。

2.根据权利要求1所述的基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列克隆入转递质粒，得到重组转递质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组转递质粒通过Tn7转座重组，将编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列转座重组到杆状病毒穿梭载体Bacmid，得到重组杆状病毒质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组杆状病毒质粒转染昆虫宿主细胞，收集上清液，得到第一代杆状病毒；

(4)将第一代杆状病毒扩大培养；

(5)将第一代杆状病毒或是扩大培养得到的杆状病毒感染昆虫宿主细胞；

(6)收集细胞，纯化，得到可溶性Flic蛋白，为基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂。

3.根据权利要求1或2所述的基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂的制备方法，其特征在于：所述的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列。

4.根据权利要求1或2所述的基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂的制备方法，其特征在于：所述的编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.3所示的序列。

5.根据权利要求2所述的基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂的制备方法，其特征在于：

所述的转递质粒为pFastBac^TM 1；

步骤(2)中所述的Tn7转座重组通过如下步骤实现：将所述的重组转递质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，通过Tn7转座重组，将编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列转座重组到杆状病毒穿梭载体Bacmid，得到重组杆状病毒质粒；

步骤(3)中所述的转染为脂质体转染法；

步骤(3)中所述的昆虫宿主细胞为Sf9细胞；

步骤(4)中所述的扩大培养指的是将第一代杆状病毒感染昆虫宿主细胞，上清液即为杆状病毒，依据实际需求重复将得到的病毒继续感染昆虫宿主细胞的步骤，获得更大量的杆状病毒；

步骤(5)如下：将第二代重组杆状病毒以MOI＝1～5感染细胞密度为2.5×10⁶个细胞/ml的sf9细胞，27～28℃悬浮培养72h后收集细胞；

步骤(6)中所述的纯化的具体步骤如下：将收集得到的细胞进行超声波处理，处理液进行固液分离，将得到的上清液采用Ni-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白，得到可溶性Flic蛋白。

6.根据权利要求5所述的基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂的制备方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的扩大培养包括如下具体步骤：将第一代重组杆状病毒以MOI＝0.1感染细胞密度为2×10⁶个细胞/ml的sf9细胞，27～28℃悬浮培养72h后收取细胞培养上清即为第二代重组杆状病毒；

所述的超声波处理的条件如下：工作时间3s，间歇时间5s，工作功率100～200w，破碎时间10～15min；

所述的固液分离的方法为离心；

所述的Ni-NAT亲和层析法的步骤具体如下：将上清液上Ni-NAT柱，将上清液和Ni充分混匀后静置，待未结合的蛋白液通过重力作用流出Ni-NAT柱后，先用100mM咪唑洗脱杂蛋白，再用200～500mM咪唑直接洗脱带有His的目的蛋白，得到可溶性Flic蛋白。

7.一种基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的制备方法得到。

8.权利要求7所述的基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂在制备疫苗中的应用。