[发明专利]基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂及制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂及制备方法和应用。本发明是将编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列通过Bac‑to‑Bac杆状病毒表达系统进行表达，纯化，得到的可溶性Flic蛋白即为Flic免疫佐剂。本发明提供的方法得到的可溶性Flic蛋白产量高，而且有极高的理化特性、生物学活性、免疫原性和安全性。用该Flic免疫佐剂制备得到的灭活禽流感疫苗，免疫后可快速产生高滴度的HI抗体效价，同时可以诱导产生细胞免疫反应，具有良好的免疫原性和反应性。

技术领域

本发明属于生物制品领域，特别涉及一种基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂及制备方法和应用。

背景技术

佐剂是一类先于抗原或与抗原同时注入到家禽体内，可以加速、延长或增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，但自身并无免疫原性且不能引起机体免疫应答的物质。作为一类独特的细菌病原相关分子模式(病原体相关分子模式，PAMPs)，鞭毛蛋白具有激活Toll样受体5(TLR5)和NLR家族(NLRC4)两条信号通路的免疫活性，可以产生广泛的天然免疫应答以及对特定抗原的获得性免疫应答，从而有效激活机体的细胞和体液免疫反应。

目前大肠杆菌表达载体，因其具有易培养，表达量高的特点，常作为表达目的蛋白的常用载体，但其表达系统不具有完备的翻译后加工修饰功能，使得表达产物的生物活性较低，且其表达产物常以包涵体形式存在，使得产物纯化困难。

因此，需要研发一种活性更高的免疫佐剂。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的Flic免疫佐剂。

本发明的再一目的在于提供上述Flic免疫佐剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂的制备方法，包括如下步骤：是将编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行表达，纯化，得到的可溶性Flic蛋白；优选包括如下步骤：

(1)将编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列克隆入转递质粒，得到重组转递质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组转递质粒通过Tn7转座重组，将编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列转座重组到杆状病毒穿梭载体Bacmid，得到重组杆状病毒质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组杆状病毒质粒转染昆虫宿主细胞，收集上清液，得到第一代杆状病毒；

(4)将第一代杆状病毒扩大培养；

(5)将第一代杆状病毒或是扩大培养得到的杆状病毒感染昆虫宿主细胞；

(6)收集细胞，纯化，得到可溶性Flic蛋白，为基于杆状病毒表达系统的Flic免疫佐剂。

所述的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列；优选在如SEQ ID NO.1所示的序列的N端和/C端添加6×HIS标签，以有利于后期纯化。

所述的编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.3所示的序列；优选如SEQ ID NO.4所示。

所述的转递质粒优选为pFastBac^TM 1，是将所述的编码鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的核苷酸序列构建于该转递质粒的P_H启动子下游。从而，Flic基因的表达由苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)多角体(P_H)启动子控制，有利于Flic基因在昆虫细胞中的高水平表达。