[发明专利]一种制备载药外泌体的方法及载药外泌体

说明书

本发明涉及一种制备载药外泌体的方法及载药外泌体。所述方法包括以下步骤：步骤（1）：利用无外泌体的培养基培养改造HEK293T细胞并收集细胞；步骤（2）：将HEK293T细胞置于具有多个直径为200‑600 nm通道的基材内培养，然后将基材放入目标质粒DNA的缓冲液中，先进行电穿孔，然后定向电流刺激8‑12小时；步骤（3）：对所得缓冲液进行超速离心，收集沉淀并用缓冲溶液进行重悬得到负载基因药物的外泌体。利用所述方法，能够获得大量的载药外泌体，同时大大提高了外泌体的核酸药物包载量。同时，该方法将外泌体纯化和载药步骤合二为一，使细胞分泌的负载目标基因药物的外泌体，同时极大改善其产量、靶向性和适用性。

技术领域

本发明涉及药物载体的技术领域，尤其是涉及一种制备载药外泌体的方法及载药外 泌体。

背景技术

随着生物医学技术的发展，纳米级药物输送系统已经获得了令人瞩目的进展，各种 基于纳米的药物制剂已被用于改善化学和生物分子药物的治疗功效。使用纳米药物载体进 行癌症治疗的研究正在广泛进行，但是作为药物载体针对药物的装载尤其是基因治疗药物 受限于弱靶向性，易于降解，从而影响疗效。因此，开发安全、高效、靶向的药物递送系 统是实现肿瘤有效治疗的关键。

外泌体是一种活细胞在生理或病理状态下主动分泌到细胞外的膜性囊泡，其携带蛋 白，运送RNA，其内容物包括蛋白质、短链肽、DNA片段、lncRNA、磷脂以及miRNA。研 究发现肥大细胞、树突状细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、间充质干细胞及肿瘤细胞等都可 以产生并释放外泌体。外泌体可递送化学药物、蛋白质及肽配基和基因药物等多种药物， 以外泌体为基础的治疗方法已被广泛研究用于药物递送，以获得更好的结果。最近的研究 表明，它们具有低免疫原性、高耐受性、可生物降解性和无毒等特性，因此它们是理想的 药物递送载体，与现有的合成递送系统相比具有各种优势。此外，它们有助于提供保护性 屏障，可以延长药物的血浆半衰期并提高血液中的药物水平。因此，各种报告表明，外泌 体可以用作有效的纳米载体，以提供小的干扰RNA和微小RNA、蛋白质或化学药物来改善 癌症的治疗。

目前绝大多数方法制备的外泌体收集量相对较小，核酸药物载量低，难以满足临床 试验的需要。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供一种通过改造分泌外泌体量较 大的HEK293T细胞大量生产外泌体来制备载药外泌体的方法，所述方法大幅提高了所得外 泌体的产量以及核酸药物的包载量，从而满足临床试验的需要。利用所述方法，能将所得 外泌体上的基因药物(例如miRNA)的载药量提高50-100倍。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

在第一方面，提供了一种制备载药外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤(1)：利用无外泌体的培养基培养改造HEK293T细胞并收集细胞；

步骤(2)：将HEK293T细胞置于具有多个直径为200-600nm通道的基材内培养，然后将基材放入目标质粒DNA的缓冲液中，先进行电穿孔，然后定向电流刺激8-12小时；

步骤(3)：对所得缓冲液进行超速离心，收集沉淀并用缓冲溶液进行重悬得到负载基因药 物的外泌体。

通过利用所述技术方案，利用定向电流能够使细胞膜受到损伤，带负电的核酸质粒 顺着电势差从纳米孔道中进入细胞内，细胞开始修复膜并将目标质粒DNA转录为mRNA或miRNA，同时大量分泌外泌体，以排出电流强制注入的外来质粒，从而实现细胞外泌体的 大量分泌。该方法将外泌体纯化和载药步骤合二为一，使细胞分泌的外泌体负载目标mRNA 或miRNA，从而极大改善其产量、靶向性和适用性。

在一较佳示例中，根据第一方面所述的技术方案可以进一步配置为：所述步骤(1)包括以下步骤: