[发明专利]过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法

权利要求书

1.一种过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)NK细胞分离与激活

NK细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；

(2)构建hACE2过表达载体

①引物设计和合成：根据hACE2 mRNA序列设计引物；

②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；

③采用RT-PCR扩增hACE2基因；

④将hACE2基因与pEGFP-N1质粒片段连接得到hACE2过表达载体pEGFP-N1-hACE2；

(3)电转将hACE2过表达载体转进NK细胞

NK细胞中加入电转液和hACE2过表达载体进行电转，电转结束后，继续培养，收集细胞；

(4)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞

电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离，分离所得hACE2阳性NK细胞扩大培养，即得过表达hACE2基因的NK细胞制剂。

2.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的引物如下：

ACE2F：5’-catgaagcctatgtcaagctcttcctggctcc-3’

ACE2R：5’-catggaattcctaaaaggaggtctgaacatc-3’。

3.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的电转液组成如下，以体积百分比计：

无钙镁PBS 90％

无血清培养基RPMI 1640 10％；

以无钙镁PBS和无血清培养基RPMI 1640的总体积为100％计，EDTA加入量为30g/L，蔗糖加入量为200mmol/L。

4.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的电转液的制备方法是将无钙镁PBS与无血清培养基RPMI 1640混合，然后加入EDTA和蔗糖，溶解后再过滤除菌，即得。

5.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的继续培养时间为48-72h。

6.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是电转结束后收集的细胞用PBS清洗两次，带有hACE2抗体的磁珠结合表达hACE2的NK细胞，分离得到hACE2阳性NK细胞。

7.根据权利要求6所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是收集含有不超过6×10⁶个细胞的200μl悬液，按1∶20体积比加入兔抗人hACE2抗体，4℃冰箱孵育1h；之后按照20μl小鼠抗兔IgG1磁珠对应80μl细胞悬液比例，4℃冰箱孵育15min，PBS缓冲液清洗2次后制备1ml细胞悬液备用；将PBS缓冲液湿润后的MS分选柱子放入分选器中，加入制备好的细胞悬液，hACE2阳性的NK细胞会通过物理磁场力吸附在分选柱子中，hACE2阴性NK细胞会直接流出分选柱子。