[发明专利]过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法。NK细胞分离与激活，构建hACE2过表达载体，电转将hACE2过表达载体转进NK细胞，采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞，即得过表达hACE2基因的NK细胞制剂。本发明首先确定了能够实现特异性、高效识别新冠状病毒和SARS病毒靶位点的人hACE2基因序列，而后通过质粒电转染的方法导入NK细胞，利用免疫磁珠筛选hACE2阳性细胞群及测序鉴定，获得过表达hACE2基因的NK细胞。本发明过表达hACE2基因的NK细胞制剂的生产，大大提升了NK细胞消除以hACE2为受体的病毒能力。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法。

背景技术

NK细胞来源于骨髓造血干细胞，其发育成熟依赖于骨髓及胸腺微环境，其表面标志主要有CD3、CD56、CD16等。通常情况下，体内的NK细胞多处于休眠状态，信号因子激活后，NK细胞无须抗原刺激和MHC的限制可非特异直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用，构成了机体第一道免疫杀伤防线。NK细胞在体外和动物实验中均已验证对多种突发病毒感染疾病有很好的抑制和消除能力，包括SARS、H5N1、埃博拉、登革热以及HIV等。

ACE2是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的关键分子，也是包括肺泡上皮细胞在内的多种人体细胞表面表达的重要分子之一。2003年，hACE2被鉴定为SARS冠状病毒的功能性受体。hACE2分子也是ncov-2019病毒感染的关键分子，通过结合hACE2分子有可能影响ncov-2019病毒感染人体细胞的过程。

目前，亟需提供一种可以与新冠状病毒、SARS病毒等各种病毒结合，进而杀死病毒，提高对病毒的清除效率的过表达hACE2基因的NK细胞制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，制得的过表达hACE2基因的NK细胞制剂能让NK细胞更精准的与包括新冠状病毒、SARS病毒在内的可以与hACE2蛋白结合的各种病毒进行结合，进而杀死病毒，大大提高对病毒的清除效率。

本发明所述的过表达hACE2基因的NK细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)NK细胞分离与激活

NK细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；

(2)构建hACE2过表达载体

①引物设计和合成：根据hACE2 mRNA序列设计引物；

②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；

③采用RT-PCR扩增hACE2基因；

④将hACE2基因与pEGFP-N1质粒片段连接得到hACE2过表达载体pEGFP-N1-hACE2；

(3)电转将hACE2过表达载体转进NK细胞

NK细胞中加入电转液和hACE2过表达载体进行电转，电转结束后，继续培养，收集细胞；

(4)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞

电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离，分离所得hACE2阳性NK细胞扩大培养，即得过表达hACE2基因的NK细胞制剂。

步骤(2)中所述的引物如下：

ACE2F：5’-catgaagcctatgtcaagctcttcctggctcc-3’

ACE2R：5’-catggaattcctaaaaggaggtctgaacatc-3’。