[发明专利]一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法

权利要求书

1.一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，所述对核酸酶活性进行特异性调控的方法包括：

步骤一，对不同突变位点的基因序列，设计相应的Guiding链；

步骤二，合成制备所需的Guiding链；

步骤三，将Guiding链与探针检测体系混合，使底物链转化为长度更长的DNA双链，Guiding链与底物链的比例为2:1；

步骤四，向包含Guiding链和探针检测体系的混合体系中加入Endo IV，并进行实时荧光测定；

步骤一设计Guiding链的方法包括：

步骤1，确定底物链的探针杂交域，所述底物链为待检测的目标序列；

步骤2，设计两条DNA单链，所述DNA单链为Guiding链，使两条Guiding链其与底物链的探针杂交结构域外的部分互补且探针与Guiding链之间无碱基间隙，一起构成核酸酶优先结合的长双链结构。

2.如权利要求1所述的对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，Guiding链的长度大于20-nt。

3.如权利要求1所述的对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，若突变位置过于靠近底物链5’或3’端，只引入一条Guiding链与底物杂交结构域外互补。

4.如权利要求1所述的对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，步骤2对核酸酶活性进行调控的方法包括：

步骤I，设计反应体系，合成制备寡核苷酸链；反应体系包括核酸酶，探针，缓冲液，H₂O和双链DNA；探针序列为SEQ ID NO：1，引物序列为SEQ ID NO：2，双链DNA为序列包括SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4；

步骤II，配置反应体系，在400uL酶标条中，加入100nM探针，5uL ThermoPol缓冲液，0.1单位Endo IV或2单位APE-1或2单位lambda exo，并用去离子水补齐到50uL总体积；

步骤III，向上述反应体系中加入不同量，不同长度的双链DNA，放入荧光检测仪器中，进行实时荧光测定;

热程序：37℃，每20s测定一次荧光值。

5.如权利要求1所述的对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，步骤四进行实时荧光测定的方法进一步包括：

步骤i，设计反应体系，合成制备寡核苷酸链，靶标为EGFR-L858R突变，依据该突变的DNA序列，设计Endo IV参与的核酸检测体系所需的底物链MT序列为SEQ ID NO：6，WT序列为SEQ ID NO：7；探针probe，探针序列为SEQ ID NO：1，阻断链blocker序列为SEQ ID NO：5以及相应的Guiding链序列包括SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9；

步骤ii，配置反应体系,在400uL酶标条中，加入100nM probe，1000nM MT/WT，2000nMblocker， 5uL ThermoPol缓冲液，0.1单位Endo IV，向其中一组加入2000nM Guiding-1，2000nM Guiding-2，另一组不加，两组均用去离子水补齐到50uL总体积；

步骤iii，将上述反应体系迅速放入荧光检测仪器中，进行实时荧光测定；

热程序：37℃，每20s测定一次荧光值。

6.如权利要求1所述的对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，步骤四进行实时荧光测定的方法进一步包括：

步骤（a），设计反应体系，合成制备寡核苷酸链；靶标为EGFR-L858R突变，依据该突变的DNA序列，设计Endo IV参与的核酸检测体系所需的底物链MT，WT，探针probe，阻断链blocker以及相应的Guiding链；

步骤（b），配置反应体系，不同比例突变体的50µL反应体系：

探针量：1000nM；

突变比例：100%，10%，1%，0.5%，0.1%，0.01%，0%，混合链总量均为1000nM；

阻断链量：2000nM；

Guiding链量：2000nM；

Endo IV量：0.1单位；

步骤（c），将上述反应体系迅速放入荧光检测仪器中，进行实时荧光测定;

热程序：37℃，每20s测定一次荧光值。