[发明专利]一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法

说明书

本发明属于DNA序列检测技术领域，公开了一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法，对不同突变位点的基因序列，设计相应的Guiding链；合成制备所需的Guiding链；将Guiding链与探针检测体系混合，使Guiding链与底物链的比例为2:1；向上述混合体系加入Endo IV，使底物链转化为长度更长的DNA双链，并进行实时荧光测定。本发明涉及的调控内切酶IV/APE‑1/lambda外切酶活性，降低了由于核酸酶副活性而产生的背景信号，同时最大程度的保留核酸酶切割目标序列的主活性，从而提高检测效能。

技术领域

本发明属于DNA序列检测技术领域，尤其涉及一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法。

背景技术

目前，核酸酶是生物学、化学和医学研究中被广泛使用的工具。它们被广泛应用于生物传感器、基因编辑技术和新药物的研制上。不同的核酸酶具有不同的切割特性，对应的底物也各不相同。在实际应用的层面，目前对核酸酶的应用都是基于其可以预测的工作机制。例如，我们通常希望Endo IV能够稳定且专一地切割具有空位的DNA双链。然而，核酸酶容易受到体系中其他核酸链的干扰，其切割特性并不稳定。尤其是对于以双链DNA为靶目标链的核酸酶，它们经常非特异性地切割核酸单链。这一现象往往导致意料之外的串扰，对核酸酶在各个领域的应用形成很大的限制。

在酶-核酸探针领域，广泛使用的lambda exonuclease，APE1和Endo IV均易发生预料之外的非特异酶切现象，严重限制了酶-探针检测体系的实际应用。因为在酶-探针检测体系中，不与野生链结合的核酸探针以单链的形式大量存在。如果核酸酶切割单链核酸探针，荧光信号就会作为背景信号大量产生，导致突变链和野生链之间的区分度减少甚至消失。这对于一个检测体系来说是不可接受的。针对这一问题，目前并没有简明有效的方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：(1)核酸酶切割单链的现象普遍存在且严重干扰酶-核酸探针体系的正常工作，降低检测效能；

(2)该现象难以预测，目前的方法只能是盲目的优化探针序列以尽可能地避免核酸酶对单链探针的自切割，导致成本极高。

解决以上问题及缺陷的难度为：核酸酶在DNA双链和DNA单链上的分配机理尚不明确。抑制核酸酶副活性的同时需要保持核酸酶主活性不受影响。

解决以上问题及缺陷的意义为：提供了一种全新的抑制核酸酶副活性的方法，扩大了核酸酶的应用范围；保证酶-探针体系正常工作，使检测效能保持稳定；避免当前方法中盲目优化探针序列的环节，降低了成本。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法。可应用于核酸信号放大、单核苷酸多态性(SNP)分型以及低丰度点突变检测等技术领域。

本发明是这样实现的，一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法，在抑制核酸酶副活性的同时不影响核酸酶主活性，保证酶-探针体系正常工作，使检测效能保持稳定，包括：

步骤一，对不同突变位点的基因序列，设计相应的Guiding链；

步骤二，合成制备所需的Guiding链；

步骤三，将Guiding链与探针检测体系混合，使Guiding链与底物链的比例为2:1；

步骤四，向上述混合体系加入Endo IV，使底物链转化为长度更长的DNA双链，并进行实时荧光测定。

进一步，步骤一设计Guiding链的方法包括：

步骤1，确定底物链的探针杂交域，所述底物链为待检测的目标序列；

步骤2，设计两条DNA单链，所述DNA单链为Guiding链，使两条Guiding链其与底物链的探针杂交结构域外的部分互补，一起构成核酸酶优先结合的长双链结构。