[发明专利]一种微生物混菌发酵与原位萃取相结合生产丁酸丁酯的方法

说明书

本发明公开了一种利用微生物混菌发酵与原位萃取相结合生产丁酸丁酯的方法，包括以下步骤：（1）将活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种到发酵培养基中进行发酵；（2）发酵24 h后，加入脂肪酶和萃取剂继续发酵；本方法丁酸丁酯的产量最高达到16.77 g/L，收率为0.30 g/g。与传统的化学法生产的丁酸丁酯相比，生物法所得的天然丁酸丁酯更加适合应用于食品及化妆品等行业，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种生物发酵与酯化萃取相结合生产丁酸丁酯的方法。

背景技术

丁酸丁酯是一种应用广泛的短链脂肪酸酯，作为溶剂广泛用于有机合成过程；因具有梨、菠萝样香气，是调制食品、饮料及日用化妆品、香精等不可缺少的原料，也是我国GB2760-86 规定允许使用的食用香料。此外，丁酸丁酯在低温下具有与航空柴油相似的理化性质，可直接用作航空燃料，是一种更高附加值的燃料添加剂。丁酸丁酯天然存在于菠萝、香蕉和草莓等水果中，然而含量非常低。传统生产工艺以丁酸和丁醇为原料、浓硫酸为催化剂，通过酯化反应合成，该工艺虽然技术成熟、产品收率高，但存在副反应多、设备腐蚀严重、 “三废”排放量大等弊端。利用脂肪酶催化合成丁酸丁酯，产品纯度高，然而收率较低、 底物和酶成本较高，限制了其大规模应用。 因此， 迫切需要开发新型生产工艺，实现丁酸丁酯的高效合成。生物发酵法合成丁酸丁酯能以可再生的生物质为原料，具有反应条件温和、产品纯度高、过程绿色环保等优势；且生物发酵合成的丁酸丁酯更受消费者青睐（约1100元/千克），其价格要远远高于化学合成的丁酸丁酯（约 60元/千克），因此，在食用香精和日化香料等领域具有更广泛的市场。

生物发酵法合成丁酸丁酯能以溶剂梭菌（Clostridium sp.）发酵单糖获得丁醇，通过外源添加丁酸和脂肪酶，催化丁酸和丁醇酯化获得。溶剂梭菌在丙酮-丁醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol, ABE）发酵过程中，具有产酸期（主要是丁酸）和产醇期（主要是丁醇）两个阶段，在产酸期合成的丁酸可诱导丁醇合成酶基因的表达并转化成丁醇。丁醇具有脂溶性的特性，在较低浓度下（10 g/L左右） 可裂解细胞膜，对细胞产生毒害作用。因此，与生物乙醇或其它化学品发酵相比，生物丁醇的合成浓度和收率较低，限制了其大规模开发与应用。通过生物转化法把丁醇转化成更高附加值并对细胞无毒性的丁酸丁酯也为生物丁醇的高值化转化提供了新的思路。

目前，国外研究人员已开展了生物发酵法合成丁酸丁酯的工作，基于合成类型分为三类：

1）一步发酵法直接合成丁酸丁酯，即以单糖为底物直接发酵合成丁酸丁酯，目前最高为0.05 g/L;

2）基于溶剂梭菌ABE发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加丁酸和脂肪酶合成丁酸丁酯，目前报道最高为22.4 g/L（以70 g/L木糖为底物并添加7.9 g/L丁酸以及5g/L脂肪酶）;

3）基于产丁酸梭菌发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加丁醇和脂肪酶合成丁酸丁酯，目前报道最高为36.9 g/L（以50 g/L葡萄糖为底物并添加5 g/L脂肪酶以及连续补加10 g/L丁醇以及以及5 g/L脂肪酶）。由于酪丁酸梭菌只能生产丁酸而不产丁醇，且丁酸和丁醇是1:1酯化成丁酸丁酯，这意味着其丁醇总添加量必定大于18.45 g/L。

与一步发酵法合成丁酸丁酯相比，基于溶剂梭菌 ABE 发酵和产丁酸梭菌发酵可合成较高产量的丁酸丁酯，然而发酵过程需添加大量的底物和脂肪酶，提高了生物法合成丁酸丁酯的成本。因此，迫切需要利用代谢工程和过程工程等手段，消除对前体物和脂肪酶的依赖；本发明通过将丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌混菌发酵的手段成功消除了对前体物（丁醇、丁酸）的依赖。

发明内容

发明目的：为了解决丁酸丁酯生物合成方法对前体物依赖造成成本过高的问题，本发明提供了一种微生物混菌发酵与原位萃取相结合生产丁酸丁酯的方法。

技术方案：本发明所述一种微生物混菌发酵与原位萃取相结合生产丁酸丁酯的方法，包括以下步骤：