[发明专利]一种sgRNA及其在修复内含子异常剪接中的应用

权利要求书

1.一种针对细胞中由于HBB(β-珠蛋白基因)IVS2-654 CT突变导致内含子异常剪接的修复方法，所述IVS2-654 CT的突变引入额外的剪接供体位点导致内含子异常剪接，其特征在于，所述方法包括利用CRISPR-Cas9系统对HBB进行基因编辑以删除所述额外的剪接供体位点的步骤；

所述CRISPR-Cas9系统包括Cas9和靶向目标序列的sgRNA；

所述sgRNA包括sgRNA-U和sgRNA-D，

所述sgRNA-U的靶向位点在IVS2-654 CT位点的上游21bp至IVS2-654CT位点所在的HBB基因第二内含子起始位点范围内，

所述sgRNA-D的靶向位点在IVS2-654 CT位点的下游71bp至IVS2-654CT位点所在的HBB基因第二内含子终止位点范围内。

2.根据权利要求1所述的修复方法，其特征在于，所述sgRNA-U的靶向序列为SEQ IDNo.1-35所示序列中的任一种或任两种以上；优选的，SEQ ID No.1、2、和/或3所示序列，更优选的，所述sgRNA-U包括碱基的化学修饰。

3.根据权利要求1或2所述的修复方法，其特征在于，所述sgRNA-D的靶向序列为SEQ IDNo.36-51所示序列中的任一种或任两种以上；优选的，SEQ ID No.36、37、38和/或39所示序列；更优选的，所述sgRNA-D包括碱基的化学修饰。

4.根据权利要求1-3中任一所述的修复方法，其特征在于，所述额外的剪接供体位点的序列为AAGGTAATA。

5.根据权利要求1-4中任一所述的修复方法，其特征在于，采用电转化的方法向细胞中引入包含Cas9和sgRNA-U的复合物、以及Cas9和sgRNA-D的复合物。

6.根据权利要求1-7中任一所述的修复方法，其特征在于，所述细胞为造血干细胞或红系祖细胞，

优选的，所述造血干细胞为CD34⁺的造血干祖细胞，所述红系祖细胞为HUDEP-2。

7.一种用于修复由HBB(β-珠蛋白基因)IVS2-654 CT突变导致的内含子异常剪接的sgRNA，所述sgRNA包括sgRNA-U和sgRNA-D，

所述sgRNA-U的靶向位点在IVS2-654 CT位点的上游21bp至IVS2-654CT位点所在的HBB基因第二内含子起始位点范围内；

所述sgRNA-D的靶向位点在IVS2-654 CT位点的下游71bp至IVS2-654CT位点所在的HBB基因第二内含子终止位点范围内。

8.根据权利要求7所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA-U的靶向序列为SEQ ID No.1-35所示序列中的任一种或任两种以上；优选的，SEQ ID No.1、2、和/或3所示序列，更优选的，所述sgRNA-U包括碱基的化学修饰；

所述sgRNA-D的靶向序列为SEQ ID No.36-51所示序列中的任一种或任两种以上；优选的，SEQ ID No.36、37、38和/或39所示序列；更优选的，所述sgRNA-D包括碱基的化学修饰。

9.权利要求7或8所述的sgRNA在修复细胞中由HBB(β-珠蛋白基因)IVS2-654 CT突变导致的内含子异常剪接中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞为造血干细胞或红系祖细胞，

优选的，所述造血干细胞为CD34⁺的造血干祖细胞，所述红系祖细胞为HUDEP-2。