[发明专利]一种sgRNA及其在修复内含子异常剪接中的应用

说明书

本申请公开了一种sgRNA及其在修复内含子异常剪接中的应用。所述sgRNA用于修复由HBB(β‑珠蛋白基因)IVS2‑654 CT突变导致的内含子异常剪接，包括sgRNA‑U和sgRNA‑D，所述sgRNA‑U的靶向位点在IVS2‑654 CT位点的上游21bp至IVS2‑654 CT位点所在的HBB基因第二内含子起始位点范围内，所述sgRNA‑D的靶向位点在IVS2‑654 CT位点的下游71bp至IVS2‑654 CT位点所在的HBB基因第二内含子终止位点范围内。本发明可利用现有基因编辑技术修复依赖输血型β‑地贫IVS2‑654 CT，编辑效率高，能高效修饰自体造血干细胞持久平衡造血系统。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种sgRNA及其在修复内含子 异常剪接中的应用。

背景技术

β-地中海贫血是一种常见的由于β-珠蛋白基因缺陷导致成人血红蛋白异常 的遗传性疾病，我国“地贫”基因携带者约3000万人，涉及近3000万家庭、1 亿人口，其中重型和中间型“地贫”患者约30万人。其中，IVS2-654 CT基因 型是我国“地贫”中较为多见的一种，发病机制为HBB基因第2内含子中的第 654位碱基发生CT突变，从而产生异常剪接位点，导致β-珠蛋白mRNA中 额外多出了73nt的外显子并提前终止翻译。

目前，中间型和重型地贫患者需要长期输血和去铁治疗来维持生命，唯一 根治方式为异体造血干胞移细植术，但主要实施障碍是我国血液资源的紧缺、 异体造血干细胞配型困难及移植相关并发症等。其中，利用慢病毒载体进行基 因治疗，表现出极大的潜力，但是半随机的载体整合方式，具致癌风险。同时 慢病毒中的表达原件在造血干细胞长期归巢和自我更新的过程中会逐渐沉默， 使得疗效下降，即有可能无法达到终身治愈的目的。另外，临床所需的高浓度、 高质量的慢病毒对设备和技术的要求极高，因此成本很难降低。因此，并行的、 更加安全、成本更低的临床方案是非常有必要的。

理想的基因治疗方法是修复或破坏病人造血干细胞DNA中传统的地贫突 变，使之重新恢复基因功能，并在内源转录控制因子的作用下永久产生野生型 成体β-珠蛋白，从而正常分化为红系细胞。DNA序列在基因编辑后的修复方 式以非同源性末端接合(Non-homologous end joining，NHEJ)修复为主，同源 重组介导的修复(Homology directedrepair，HDR)所占的比例极低，修复点 突变需要高效的HDR效率。

本发明针对致病位点的异常突变，仅需靶向切割目标DNA实现NHEJ突 变即可破坏突变位点的策略显得更具可行性。在临床上，只需将基因编辑后通 过NHEJ方式修复的自体造血干细胞移植回体内，便可达到治愈的目的。

发明内容

本发明提供了一种sgRNA及其针对β-珠蛋白基因(HBB)IVS2-654 CT 的突变导致的内含子异常剪接的修复方法。

本发明利用CRISPR-Cas9系统对IVS2-654 CT导致的内含子异常剪接进 行修复。Cas9靶向切割位点时，需要在可供靶向序列的选择上与靶点3′端紧邻 的3个碱基必须是5′-NGG-3′的形式，从而构成被Cas9本身识别的PAM (protospacer adjacent motif)结构。但是，上述致病突变位点附近并没有合适的 PAM靶向切割破坏异常剪接位点，这导致无法利用CRISPR-Cas9系统直接切 割IVS2-654 CT突变位点并进行修复。

发明人针对IVS2-654 CT导致的内含子异常剪接进行了深入的研究，发 现IVS2-654 CT的突变会使得HBB第二个内含子中产生一个额外的剪接供体 位点“AAGGTAATA”，导致产生一个多出73个碱基的异常的β-珠蛋白mRNA， 使得翻译被提前终止。理论上，在HBB基因区域破坏或删除IVS2-654 CT导 致的额外的剪接供体位点，使得其不会引发异常可变剪切，就可以使得此基因 组区域可以转录产生正常的β-珠蛋白mRNA，并翻译产生正常的β-珠蛋白。