[发明专利]一种催化性能提高的脂肪酶及其应用

说明书

本发明公开了一种催化性能提高的脂肪酶及其应用，具体公开了一种最适反应温度、活性和热稳定性提高的脂肪酶及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供一种热稳定性提高的脂肪酶CALB突变体A146G‑L278M和A146G‑L278M‑A151P的基因及酯合成应用。本发明在野生型脂肪酶基因序列的基础上，进行理性设计选择合适的突变位点，最终获得了T_m值分别提高了3.3℃和4.2℃、最适反应温度提高5℃且催化效率提高了4.1倍的突变体。

技术领域

本发明涉及一种催化性能提高的脂肪酶及其应用，具体涉及一种最适反应温度、活性和热稳定性提高的脂肪酶及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

脂肪酶具有良好的水解、转酯、酯化、酯交换等反应的催化能力，在食品、医药、精细化工、生物能源等行业中应用广泛。微生物来源的脂肪酶已成为工业应用中脂肪酶的主要来源。工业中的催化反应一般在较高的温度下进行，一方面是增加温度能提高酶反应速率，另一方面是由于温度的升高可以提高反应物的溶解度并减少微生物污染的风险。此外，也可减少冷却设备的使用，从而节约生产成本。但是自然界中天然的微生物脂肪酶在高温下极易失活，限制了脂肪酶在工业中的应用。因此，获得最适温度提高、热稳定性强、催化活性高的脂肪酶对于工业应用具有重要意义。

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)，CALB由于具有出色的酯合成、水解、转酯等催化活性，广泛应用于工业。但天然来源的CALB耐热性较差，较高温度下催化活力低，很大程度上制约了CALB在工业中的应用。因此提高CALB的最适反应温度、耐热性及催化活性对拓宽CALB的工业应用具有重要意义。

提高脂肪酶的催化特性的途径主要有两个，一是从自然界中筛选获得，二是对现有的酶进行分子改造。其中，酶的分子改造主要有两个途径，一是定向进化，二是理性设计。通过以上方法可以提高酶的一种或者两种特性，但是能够同时提高酶的多种催化特性的报道较少，如同时提高最适反应温度、耐热性及催化活性。

Xie等人通过选取活性部位附近高B-factor值的柔性位点进行突变，成功得到南极假丝酵母脂肪酶B的优势双突变体D223G/L278M，其在48℃下的半衰期为49min，为野生型的13倍；孵育15min的半失活温度(T₅₀¹⁵)为58.5℃，较野生型提高了12℃；T_m值较野生型增加了3.6℃；最适温度比野生型提高了6.5℃；催化效率(k_cat/K_m)比起野生型，无显著变化，均为38.4min^-1μM^-1。对于单突变体L278M，其在48℃下的半衰期比野生型提高了6.4倍，催化效率(k_cat/K_m)较野生型提高了40％，最适反应温度提高了2.5℃。(参考文献：Xie,Y.,An,J.,Yang,G.,Wu,G.,Zhang,Y.,Cui,L.,Feng,Y.,2014.Enhanced enzyme kinetic stabilitybyincreasing rigidity within the active site.The Journal of biologicalchemistry.289,7994-8006.)。此外，谢渊等人还成功获得了催化效率较野生型分别提高26倍和33倍的南极假丝酵母脂肪酶B突变体A281F和I285F。通过进一步组合突变成功获得热稳定性和催化效率均有所提高的三点突变体D223G/L278M/A281F，酶的热稳定性及催化效率较野生型分别有6.5倍和10倍的提升，但其最适反应温度情况并无报道(谢渊,脂肪酶活性中心区域进化提高酶动力学稳定性和催化活性.吉林大学,2014.)。