[发明专利]一种提高烟草镉敏感性的方法

说明书

本发明涉及一种提高烟草镉敏感性的方法，具体涉及利用叶盘浸染法，将MhNRAMP6在烟草内过量表达，MhNRAMP6基因的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋；其核苷酸序列如SEQ No.1所示。含超表达基因MhNRAMP6的烟草镉敏感性更强，进而降低了烟草的耐镉性，避免了由于烟草种植区重金属Cd污染加剧，导致烟草产生各种胁迫反应，而通过增加烟草根系镉的吸收，富集环境镉，达到降低外界环境镉浓度的目的。

技术领域

本发明涉及一种提高烟草镉敏感性的方法，属于镉对烟草生长影响的研究领域。

背景技术

镉(Cadmium，Cd)是具有较强毒性的重金属，较低浓度即可抑制植物生长。经长期吸收积累就会促进植物细胞产生大量活性氧，促使蛋白质变性、失活，进而破坏植物细胞膜，造成细胞内部结构损伤，破坏细胞代谢平衡，引起叶片出现斑点降低光合作用效率，导致植株生长缓慢、植株矮小，甚至引发植物病变和死亡，最终影响作物产量和品质(陈爱葵等，2013；马艳华等，2014)。随着工业化发展，水源的污染、废气的排放等已经造成我国部分用于农业产生的土壤镉含量严重超标，有的区域甚至达到124mg kg^-1(Yuan et al.,2016)。许多果园的土壤也已经被镉污染，严重威胁着果品安全(Cheng et al.,2015)。

水果和农作物可食用部分中的镉以食物链传递的方式一级一级在人体富集，对人的身体健康造成危害。镉会引起心脑血管疾病，导致高血压和心血管的扩张，还会抑制血红蛋白的合成，干扰微量元素吸收，造成肾脏功能受损害和肺部受伤害；镉还会破坏骨钙，如果长期摄入镉则会造成骨质疏松甚至脊柱畸形等问题，对生殖系统也会产生不可逆的损害，比如“痛骨病”就是一种因镉污染造成的疾病(Akesson et al，2014；张佳，2016)。

烟草(Nicotiana tabacum)是中国重要的经济作物之一(刘国顺,2003)。围绕烟草的抗病、抗逆、品质、低害和农艺等性状对烟草品种进行定向改良，一直以来都是烟草育种的工作重心(杨铁钊,2003)。烟草是分子生物学和基因工程研究的模式植物，是“植物王国的小白鼠”，很多研究将转基因技术应用到烟草上，比如利用转基因烟草清理汞污染严重的土壤、吸收军事TNT污染、获取防艾滋病病毒抗体等，因此具有重要的价值。通过调节烟草根系的镉吸收能力，对改善环境镉污染和土壤修复具有重要意义。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种提高烟草镉敏感性的方法，本发明利用超表达基因MhNRAMP6提高了烟草的镉敏感性，降低了其耐镉性。

发明人利用同源克隆和PCR技术从平邑甜茶根系中分离出一个MhNRAMP(自然抗性相关巨噬细胞蛋白)基因，它的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋，推测其可能为跨膜蛋白。MhNRAMP6与苹果的MdNRAMP6的同源性最高，高达99.08％，该基因命名为MhNRAMP6，其核苷酸序列如SEQ No.1所示。

本发明的技术方案如下：

一种提高烟草镉敏感性的方法，利用叶盘浸染法，将MhNRAMP6在烟草内过量表达。具体步骤如下：

(2)利用带有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增pMD18-T-MhNRAMP6，产物与pROKII重组并构建了含MhNRAMP6基因的植物过表达载体pROKII-MhNRAMP6，转化农杆菌GV3101，获得带目的片段的表达载体的阳性菌株；特异性引物及酶切位点为：

F:CGGGAATGGCTGTGGCCAGTACGG(BamHI)；

R：GGGGTAGGTCTACCGAAAATATCGA(KpnI)；