[发明专利]一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法

说明书

本发明涉及一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，具体涉及将MhNRAMP6基因在苹果愈伤中超表达，MhNRAMP6基因的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋；其核苷酸序列如SEQ No.1所示。含超表达基因MhNRAMP6的苹果愈伤镉敏感性更强，进而降低了苹果愈伤的耐镉性，避免了由于果园重金属Cd污染加剧，导致果树产生各种胁迫反应，影响果实产量和品质的问题。

技术领域

本发明涉及一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，属于镉对苹果生长影响的研究领域。

背景技术

镉(Cadmium，Cd)是具有较强毒性的重金属，较低浓度即可抑制植物生长。经长期吸收积累就会促进植物细胞产生大量活性氧，促使蛋白质变性、失活，进而破坏植物细胞膜，造成细胞内部结构损伤，破坏细胞代谢平衡，引起叶片出现斑点降低光合作用效率，导致植株生长缓慢、植株矮小，甚至引发植物病变和死亡，最终影响作物产量和品质(陈爱葵等，2013；马艳华等，2014)。随着工业化发展，水源的污染、废气的排放等已经造成我国部分用于农业产生的土壤镉含量严重超标，有的区域甚至达到124mg kg^-1(Yuan et al.,2016)。许多果园的土壤也已经被镉污染，严重威胁着果品安全(Cheng et al.,2015)。

水果和农作物可食用部分中的镉以食物链传递的方式一级一级在人体富集，对人的身体健康造成危害。镉会引起心脑血管疾病，导致高血压和心血管的扩张，还会抑制血红蛋白的合成，干扰微量元素吸收，造成肾脏功能受损害和肺部受伤害；镉还会破坏骨钙，如果长期摄入镉则会造成骨质疏松甚至脊柱畸形等问题，对生殖系统也会产生不可逆的损害，比如“痛骨病”就是一种因镉污染造成的疾病(Akesson et al，2014；张佳，2016)。

苹果作为全球四大水果之一，我国苹果产量和栽培面积均居世界之首。栽培苹果主要利用砧木进行嫁接繁殖(Zhou等，2016)，砧木作为苹果生产的承接者，能够调节地上部的生长发育，提高果品的产量和品质。平邑甜茶是我国原产的宝贵紧缺的优良苹果砧木资源，其根系发达，具有极强的耐涝、耐寒和抗病能力，适应性极强。通过调节砧木根系的镉吸收能力，对于改善果树地上部生长发育及果品安全问题具有重要意义。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，本发明利用超表达基因MhNRAMP6提高了苹果愈伤的镉敏感性，降低了其耐镉性。

发明人利用同源克隆和PCR技术从平邑甜茶根系中分离出一个MhNRAMP(自然抗性相关巨噬细胞蛋白)基因，它的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋，推测其可能为跨膜蛋白。MhNRAMP6与苹果的MdNRAMP6的同源性最高，高达99.08％，该基因命名为MhNRAMP6，其核苷酸序列如SEQ No.1所示。

本发明的技术方案如下：

一种提高苹果愈伤镉敏感性的方法，将MhNRAMP6基因在苹果愈伤中超表达。具体步骤如下：

(1)利用带有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增pMD18-T-MhNRAMP6，产物与pROKII重组并构建了含MhNRAMP6基因的植物过表达载体pROKII-MhNRAMP6，转化农杆菌GV3101，获得带目的片段的表达载体的阳性菌株；特异性引物及酶切位点为：

F:CGGGAATGGCTGTGGCCAGTACGG(BamHI)；

R：GGGGTAGGTCTACCGAAAATATCGA(KpnI)；

(2)将阳性菌株浸染苹果愈伤，苹果愈伤再通过含有30mg/L的卡那霉素和250mg/L的头孢霉素的MS固体培养基培养，然后利用PCR技术获得MhNRAMP6基因超表达的苹果愈伤。