[发明专利]Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下引物及试剂：

(1)普通PCR扩增引物：

HBV-WF：TGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGG；

HBV-WR：AGGAGTTCCGCAGTATGGATCG；

(2)Sanger法PCR扩增引物：

HBV-182WF：ATGTGTCTGCGGCGTTTTATCA；

(3)试剂盒中的常规试剂：HiDi、BigDye、ddH₂O。

2.一种Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的检测方法，其特征在于：采用权利要求1所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)人基因组DNA提取；

(2)普通PCR扩增体系及程序：

(2.1)配制20μL普通PCR反应体系，包括以下含量组分：

(2.2)普通PCR扩增程序：

95℃2min；依次在95℃15s，60℃10s，72℃40s，进行35个循环；72℃5min延伸；4℃保温，即得到普通PCR扩增产物；

(3)普通PCR扩增产物纯化：

采用酶解纯化法：每10μL步骤(2)得到的普通PCR扩增产物中，加1μL核酸外切酶I和2μL虾小肠碱性磷酸酶；然后于37℃酶反应15min；再于85℃酶失活15min，即得到纯化的普通PCR扩增产物；上述纯化步骤均在PCR仪里完成；

(4)Sanger法PCR扩增体系及程序：

(4.1)配制10μLSanger法PCR扩增体系，包括以下含量组分：

(4.2)Sanger法PCR扩增程序：

96℃1min；依次在96℃10s，50℃5s，60℃4min，进行25个循环；4℃保温，即得到Sanger法PCR扩增产物；

(5)Sanger法PCR扩增产物纯化及结果分析：

采用EDTA-乙醇梯度洗脱法：将步骤(4)得到的Sanger法PCR扩增产物中加入2μL EDTA和50μL无水乙醇，混匀后于12000rpm 4℃离心20min，甩尽上清液体，留取沉淀，再加入150μL 75％乙醇，混匀沉淀后于12000rpm 4℃离心10min，甩尽上清液体，然后于金属浴锅放置5-10min烘干样品，最后加入10μLHiDi溶解样品，即得到纯化的Sanger法PCR扩增产物；将所述纯化的Sanger法PCR扩增产物通过基因分析仪检测其突变位点。