[发明专利]Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括以下引物及试剂：(1)普通PCR扩增引物：前扩增引物：TGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGG；后扩增引物：AGGAGTTCCGCAGTATGGATCG；(2)Sanger法PCR扩增引物：ATGTGTCTGCGGCGTTTTATCA；(3)试剂盒中的常规试剂：HiDi、BigDye、ddH₂O。本发明采用所述试剂盒能够检测乙肝病毒耐药基因突变位点，检测方法适用于临床乙型肝炎病毒耐药基因突变的检测，技术成熟稳定，具有良好的开发和应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的试剂盒及检测方法。

背景技术

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)感染是全球最常见的肝病之一，截止2016年影响了3.9％的全球人口。我国是最主要的乙肝大国。据2006年中国人群乙肝血清流行病学调查结果，我国1～59岁人群乙肝表面抗原携带率为7.18％。慢性乙型病毒性肝炎病人约3000万。目前，核苷(酸)类似物和α干扰素为公认有效的抗乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)药物。核苷(酸)类似物因服用方便、不良反应小、适应症广泛等特点而被广泛应用，但长期服用核苷(酸)类似物，有可能产生耐药突变，是治疗慢性乙肝的主要障碍。5种常见的核苷类乙肝治疗药物有：拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯。核苷类药物初治时，某些药物的耐药发生率相对较高，如拉米夫定和阿德福韦的五年耐药率分别70％和29％。目前用于乙肝耐药检测的方法主要包括：荧光定量PCR检测、基因芯片、线性探针杂交技术等。但是，目前荧光定量PCR检测大多为单一204位点的检测试剂盒，无法同时检测多个耐药位点的突变；基因芯片检测HBV耐药位点的突变也不能得到耐药突变的准确频率，另外该方法成本太高，不适宜进行临床推广；线性探针杂交技术虽然结果准确，但检测通量低，操作繁琐，价格昂贵。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的试剂盒，能准确快速的检测乙肝病毒耐药基因突变位点，可推广使用。

本发明目的之二在于提供一种Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的检测方法，采用所述试剂盒检测乙型肝炎病毒耐药基因突变位点，便捷高效，能检测出准确突变位点，为乙肝药物的临床运用提供了技术支持。

本发明实现目的之一采用以下技术方案：

一种Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括以下引物及试剂：

(1)普通PCR扩增引物：

前扩增引物(HBV-WF)：TGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGG；

后扩增引物(HBV-WR)：AGGAGTTCCGCAGTATGGATCG；

(2)Sanger法PCR扩增引物：

Sanger法PCR扩增内引物(HBV-182WF)：ATGTGTCTGCGGCGTTTTATCA；

(3)试剂盒中的常规试剂：HiDi、BigDye、ddH₂O。

本发明实现目的之二采用以下技术方案：

一种Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的检测方法，采用所述Sanger法检测乙肝病毒耐药基因突变位点的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)人基因组DNA提取；

(2)普通PCR扩增体系及程序：

(2.1)配制20μL普通PCR反应体系，包括以下含量组分：