[发明专利]过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法

权利要求书

1.一种过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)中性粒细胞分离与激活

中性粒细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；

(2)构建hACE2慢病毒表达载体

①引物设计和合成：根据hACE2 mRNA序列设计引物；

②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；

③采用RT-PCR扩增hACE2基因；

④将hACE2基因与慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP连接得到hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2；

(3)慢病毒包装

hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2和包装质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HEK293T细胞，转染后收集病毒颗粒；

(4)病毒颗粒侵染中性粒细胞

用病毒颗粒侵染中性粒细胞，继续培养，收集细胞；

(5)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞

病毒颗粒侵染后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离，分离所得hACE2阳性中性粒细胞扩大培养，即得过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂。

2.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的引物如下：

ACE2F：5’-catggctagcatgtcaagctcttcctggctcc-3’

ACE2R：5’-catgggatccctaaaaggaggtctgaacatc-3’。

3.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的包装质粒为pMD2.G、pMDL-G/P-RRE和pRSV-REV的混合质粒。

4.根据权利要求3所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于所述的pMD2.G、pMDL-G/P-RRE和pRSV-REV的摩尔比为3：5：2。

5.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的转染时间为48-60h。

6.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的继续培养时间为48-72h。

7.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的病毒颗粒侵染后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是病毒颗粒侵染后收集的细胞用PBS清洗两次，带有hACE2抗体的磁珠结合表达hACE2的中性粒细胞，分离得到hACE2阳性中性粒细胞。

8.根据权利要求7所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的病毒颗粒侵染后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离是收集含有不超过6×10⁶个细胞的200μl悬液，按1∶20体积比加入兔抗人hACE2抗体，4℃冰箱孵育1h；之后按照20μl小鼠抗兔IgG1磁珠对应80μl细胞悬液比例，4℃冰箱孵育15min，PBS缓冲液清洗2次后制备1ml细胞悬液备用；将PBS缓冲液湿润后的MS分选柱子放入分选器中，加入制备好的细胞悬液，hACE2阳性的中性粒细胞会通过物理磁场力吸附在分选柱子中，hACE2阴性中性粒细胞会直接流出分选柱子。