[发明专利]过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法。中性粒细胞分离与激活，构建hACE2慢病毒表达载体，慢病毒包装，病毒颗粒侵染中性粒细胞，采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞，即得过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂。本发明制得的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂具有以下优点：一、竞争性的结合病毒，防止病毒对机体关键组织中细胞的侵害杀灭；二、与病毒结合后可以招募其他中性粒细胞或免疫细胞，协同杀死病毒；三、本身结合病毒后可以吞噬病毒或利用NTEs网络杀灭病毒；从而大大提高对病毒的清除效率，进而加快恢复机体免疫力。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法。

背景技术

中性粒细胞是固有免疫系统的重要组成部分，在控制和清除病毒、细菌感染中起着关键性作用。活化的上皮细胞和受伤组织驻留的巨噬细胞释放趋化因子，将中性粒细胞募集到细菌或病毒感染部位。除了经典的吞噬、脱颗粒和呼吸爆发等机制，中性粒细胞还可以释放中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil Extracellular Traps,NTEs)捕获细菌、真菌和病毒，并分泌可溶性介质如AMP，水解酶和促炎症细胞因子以进一步促进病原体的清除。NTEs是中性粒细胞核内组分释放到胞外空间形成的，由解聚的染色体网状结构和镶嵌的颗粒蛋白等多种细胞质蛋白组成。

病毒进入动物体内，一般尚无特效药物治疗，主要依靠动物机体自身的免疫能力清除它，其中中性粒细胞的主要功能之一就是清除病毒，而在实际病例中往往感染者体内会出现中性粒细胞数量降低的情况，影响到机体免疫能力，因此适量分离培养中性粒细胞后，回输患者可以弥补机体该类细胞的下降。中性粒细胞输血已被广泛应用于威胁严重中性粒细胞减少症患者生命的病毒、细菌和真菌感染治疗。

ACE2是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的关键分子，也是包括肺泡上皮细胞在内的多种人体细胞表面表达的重要分子之一。2003年，hACE2被鉴定为SARS冠状病毒的功能性受体。hACE2分子也是ncov-2019病毒感染的关键分子，通过结合hACE2分子有可能影响ncov-2019病毒感染人体细胞的过程。

目前，亟需提供一种可以与新冠状病毒、SARS病毒等各种病毒结合，进而吞噬或杀死病毒以屏蔽病毒侵染机体关键组织，且提高对病毒的清除效率的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，制得的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂可以与新冠状病毒、SARS病毒等各种病毒结合，进而吞噬或杀死病毒以屏蔽病毒侵染机体关键组织，且提高对病毒的清除效率，进而加快恢复机体免疫力。

本发明所述的过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)中性粒细胞分离与激活

中性粒细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；

(2)构建hACE2慢病毒表达载体

①引物设计和合成：根据hACE2 mRNA序列设计引物；

②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；

③采用RT-PCR扩增hACE2基因；

④将hACE2基因与慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP连接得到hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2；

(3)慢病毒包装

hACE2慢病毒表达载体pCDH-hACE2和包装质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HEK293T细胞，转染后收集病毒颗粒；

(4)病毒颗粒侵染中性粒细胞