[发明专利]用于检测丙型流感和丁型流感的双重TaqMan qPCR检测方法

权利要求书

1.一种用于检测丙型流感病毒和丁型流感病毒的qPCR试剂盒，其特征在于：包括用于检测丙型流感病毒的引物对及TaqMan探针、用于检测丁型流感病毒的引物对及TaqMan探针、反转录试剂和qPCR Mix；

所述用于检测丙型流感病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下所示：

ICV-NP正向引物：5’- AAGAGCCATGCAAGGAATTGA-3’

ICV-NP反向引物：5’- TCTGCGATGACATTTAGAGCTTC-3’

ICV-NP-Probe：5’-VIC- AAAGCGTTTCCTGGACCTTTAA-MGB-3’；

所述用于检测丁型流感病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下所示：

IDV-PB1正向引物：5’- CCCTCCTACAGGAACAGAGTTTTC -3’

IDV- PB1反向引物：5’- GCGTTGATACAACTGCCTCG -3’

IDV- PB1-Probe：

5’- FAM- AGGAACCCCTTTACACAGTTTGAGAAGACAG- BHQ1-3’。

2.一种用于检测丙型流感病毒和丁型流感病毒的双重TaqMan探针qPCR检测方法，该方法为非疾病诊断目的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，获取待检样品的cDNA：提取鼻咽拭子样品或呼吸道组织病料的总RNA，反转录为cDNA模板；

步骤2，使用2对qPCR引物和TaqMan探针进行检测：将权利要求1所述试剂盒中的引物对和TaqMan探针置于qPCR反应体系中，以步骤1中获得的cDNA作为模板，进行PCR扩增，收集荧光信号；

步骤3，根据机器测算的荧光信号及Cq值判断样品中是否有丙型流感病毒、丁型流感病毒，Cq值大于35的结果判断为阴性。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1中反转录使用Revert Aid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行，其反应总体系为20 µL，包括：1 µL Random HexamerPrimer、1 µL Oligo(dT)₁₈ Primer、5 µL nuclease-free Water、5 µL总RNA，混匀后65 ℃孵育5 min，冰浴3 min，继续加入：4 μL 5× Reaction Buffer、2 µL 10× dNTP预混液、1µL RevertAid M-MuLV Reverse transcriptase和1 µL RiboLock RNase Inhibitor。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1中反转录的反应程序为：25 ℃ 5min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，反应后得到cDNA模板。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中qPCR反应体系为：10µL 2× AceQqPCR Probe Master Mix，ICV-NP正向引物、ICV-NP反向引物、IDV-PB1正向引物、IDV- PB1反向引物各0.2 µL，ICV-NP-Probe、IDV-PB1-Probe各0.1 µL，cDNA模板2 µL，ddH₂O加至体系总体积为20 μL，其中各条引物浓度和探针浓度均为10 μM，体系总体积为20 μL。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中PCR扩增的反应程序设置为：荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：VIC；温控程序设置为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环，同时以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。