[发明专利]用于检测丙型流感和丁型流感的双重TaqMan qPCR检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测丙型流感病毒（Influenza C virus,ICV）和丁型流感病毒（Influenza D virus,IDV）的双重TaqMan探针qPCR检测方法。具体地，针对丙型流感病毒和丁型流感病毒计了特异性引物和TaqMan探针，实现了在一个PCR反应管中同时检测丙型流感病毒和丁型流感病毒。本发明可以检测最低浓度为1×10¹ copies/μL的ICV、IDV阳性样品，同时具有极佳的特异性和重复性，为这两种流感病毒的检测提供了一种简便、高效和经济的方法。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种用于检测丙型流感病毒和丁型流感病毒的双重TaqMan探针qPCR检测方法。

背景技术

流行性感冒病毒(Influenza virus)根据核蛋白和机制蛋白的抗原性不同分为甲(A)、乙 (B)、丙(C)、丁(D)四型，其中甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)在人与猪之间或禽类与猪之间的传播已使其在猪群中出现了几个自主循环的谱系，其在全世界家猪群体中广泛传播，由于IAV可引起急性呼吸道疾病，且临床上会出现病毒和细菌混合感染的现象，进一步加剧患病动物的临床症状，对畜牧业产生巨大的经济损失。

丙型流感病毒(Influenza C virus，ICV)首先在人和猪中被发现，最近也在牛群中发现。已有研究提示ICV在人与猪间存在种间传播，其跨宿主传播能力以及更广的宿主范围使其对畜牧业和公共卫生的潜在威胁可能会超出我们的预期。

丁型流感病毒(Influenza D virus，IDV)首先在猪群中发现，后续研究认为牛是其天然宿主，并在牛场工人体内检测到血清学阳性。同时IDV能够在雪貂和豚鼠之间复制和传播，而雪貂是人类流感病毒感染的模型。值得注意的是IDV表现出比ICV更广泛的细胞和宿主趋向，并其内部基因存在不断重配。这些研究表明其拥有跨宿主传播和成为人畜共患病的潜力。

ICV与IDV的同源性约为50％，但并无抗体交叉性，两者在全球广泛传播，都可感染主要的畜牧动物牛和猪。并且ICV可感染人，IDV抗体阳性也在人体内检测到，两者都具有成为人畜共患病原的潜力，对畜牧业和公共卫生具有极大的潜在威胁，但是目前对两种病毒的监测和研究仍较少，所以建立一种针对ICV和IDV的简便、高效、经济的双重检测方法，用以对猪和人类进行病毒检测和预防监测。

qPCR检测技术相比于普通PCR检测具有灵敏度高、精确度好、耗时短、无需电泳便可直接分析结果等优点，开发双重qPCR检测方法能够极大地缩短了检测过程中的物料成本和检测人员的时间成本，尤其适用于大规模的样品检测和混合感染的样品检测，在临床监测中有巨大优势。但是，由于双重qPCR在一个体系中同时存在两对引物及探针，为了保证其有效进行，两对引物和探针之间就必须要保持高度的特异性以避免出现非特异性的扩增产物和荧光信号，并且还必须要保持相对一致的扩增效率以便于对模板量进行测算。另外，模板中更为复杂的核酸环境，不同引物对所要求的不同的退火温度也都是制约双重qPCR检测方法建立的重要因素。所以，建立一种双重TaqMan探针法qPCR检测方法具有很高的研究和临床实用价值，但实现起来颇具难度。

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术中缺少用于检测丙型流感病毒(ICV)和丁型流感病毒 (IDV)的双重检测方法这一技术问题，本发明提供了一种用于检测丙型流感病毒和丁型流感病毒的双重TaqMan探针qPCR检测方法。

技术方案：

用于检测丙型流感病毒和丁型流感病毒的qPCR引物组，包括用于检测丙型流感病毒的引物对及TaqMan探针、用于检测丁型流感病毒的引物对及TaqMan探针，具体地：

所述用于检测丙型流感病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下所示：

ICV-NP(F)：5’-AAGAGCCATGCAAGGAATTGA-3’