[发明专利]一种检测三七圆斑病菌的LAMP引物及方法

权利要求书

1.一种用于检测三七圆斑病菌的LAMP引物，其特征在于，所述引物包括如下：

F3：5’- GCCTGTTCGAGCGTCATT -3’；

B3：5’- TCAGCGGGTATCCCTACC -3’；

FIP：5’- ACGCCGGCTGCCAATTGTTTTA-CCTCAAGCTCTGCTTGGTG -3’；

BIP：5’- CTTCGGAGCGCAGCACATTTTG-TCCGAGGTCAAGAGCGTTAA -3’。

2.一种利用权利要求1所述引物用于检测三七圆斑病菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）待测样品DNA的提取：按照CTAB法或采用商品化试剂盒提取待测样品基因组DNA；

（2）LAMP扩增反应：以步骤（2）提取的待测样品DNA为模板，用步骤（1）的引物进行LAMP反应，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：63℃温育60 min；

（3）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ 1.0 μL，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在三七圆斑病菌，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在三七圆斑病菌。

3.根据权利要求2所述的三七圆斑病菌的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP反应混合液由以下组分组成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100。

4.权利要求1所述的引物或权利要求3所述的LAMP检测方法在三七圆斑病菌的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。