[发明专利]一种检测三七圆斑病菌的LAMP引物及方法

说明书

本发明公开了一种三七圆斑病菌的LAMP 检测引物组及方法，属于生物安全检测领域。发明以三七圆斑病菌ITS基因为检测靶标，设计和筛选一套特异性检测的引物组，以及适用于该引物组的LAMP检测体系和反应条件。本发明解决了现有技术检测周期长、灵敏度不高、特异性不强、操作复杂、仪器设备要求高等缺陷，提供了一种特异性强、灵敏度高、操作简便、对环境设备要求不高、低成本的LAMP快速准确检测技术，特别适合三七圆斑病田间样品快速检测，为三七圆斑病的诊断与防控提供了一种方法。

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种检测三七圆斑病菌的LAMP引物及方法，可用于三七圆斑病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于三七圆斑病菌的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

三七【Panax notoginseng (Burk.) F H Chen】又称田七、金不换，誉有“南国神草”称号，是一种五加科（Araliaceae）人参属多年生宿根名贵中药材，具有活血、化淤、消肿定痛、抗炎症、抗氧化和抗衰老等功效。三七经过数百年的人工驯化种植，现已形成大面积种植于云南和广西等省份（区）。由于长期大规模、单一、连片种植，加之三七喜冬暖夏凉、半阴和潮湿的生态环境，不耐严寒与醋热，因其生长环境的特殊性，常导致三七各种病害的发生和流行。研究表明，三七地上部分的主要病害有黑斑病、炭疽病、灰霉病、圆斑病和病毒病等。其中，由毁灭柱孢菌（Mycocentrospora acerina）引起的圆斑病是三七种植区的一种重要病害，该病害具发病突然，蔓延迅速的特点，可为害三七各个部位，叶片发病初期叶背面呈现黄色小点，在天气潮湿或连续阴雨天，迅速扩大成透明状圆形病斑，随后病斑合并，叶片腐烂脱落，发病后天气干燥时，病斑较大，圆形褐色，有明显轮纹。茎顶与花轴顶受害后呈水渍状缢缩折垂，茎秆基部受害时，受害部位呈板粟色，在湿度较大的条件下病部表面产生稀疏灰白色霉层，可引起茎基腐，病菌落入土中，侵染植株芽苞、芦头及块根，导致溃烂。三七圆斑病一般发病损失20%-50%，严重时可造成绝产，常给三七生产带来巨大损失，是影响三七产业化健康可持续发展的关键因子之一。

病原菌的准确鉴定与检测是病害防控的前期基础，病原菌传统的鉴定和检测流程通常如下：从发病组织中分离病原菌、采用形态学特征对病原菌进行初步鉴定、再通过柯赫氏法则（将病原菌重新回接到寄主植株上，待发病后再重新分离、鉴定，并与原始菌株进行比较）对病原菌进行最终确定。这种运用形态学方法进行鉴定不仅困难且耗时费力，不能满足病害快速、准确鉴定、诊断的需求。随着分子生物学技术的发展，常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等DNA体外PCR扩增技术成功地应用于植物病原菌的准确鉴定和快速检测中。PCR技术虽然提升了病原菌鉴定的准确性和检测的快速性，但仍存在需要依赖精密的PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备、操作繁琐和操作人员需具备一定分子生物学技术等问题，使得该技术在经济欠发达地区和基层农业部门的使用、推广受到很大的限制。因此，很有必要建立新的检测技术以期实现对三七圆斑病菌快速、简便检测。

环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术。该技术针对靶标基因6个特异区设计4条引物，只要其中任何一条引物也靶标错位均不能扩增，所以该技术具有很强的特异性，此外，LAMP可利用高活性的链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase)在60℃~65℃恒温条件下对目的DNA片段进行高效扩增，仅需要简单的水浴锅便可满足反应要求，整个反应在1小时内完成，并且可用肉眼观察判断结果。LAMP技术具特异性强、设备要求低、操作简单、灵敏度高、反应时间短等优点被广泛应用于多种病原菌检测中。截至目前为止，尚未见有LAMP技术用于检测三七圆斑病菌的相关技术报道。为进一步改进与完善三七圆斑病菌的检测技术，迫切需要建立一种简便、快速、且灵敏的LAMP检测方法。

发明内容