[发明专利]一种硒单糖的酶催化检出方法

说明书

本发明涉及一种细胞色素P450单加氧酶(CYP236A20)、铁氧化还原蛋白(FoX)、铁氧还蛋白还原酶(FoR)和四甲基联苯胺(TMB_red)在检测硒单糖或制备硒单糖检出试剂中的应用，被检测的硒单糖为1β‑甲基硒‑2‑N‑乙酰基‑D‑半乳糖胺(GalNAc1SeMe)，其为人体尿液中的代谢排出物。本发明还提供了该硒单糖的新检出方法，即以CYP236A20作为催化剂和底物的受体，以FoX和FoR为电子传递媒介，以还原型TMB_red为质子供体和显色剂；利用酶与待测物中甲基硒官能团的识别，将该配基脱去，该过程伴随四甲基联苯胺的氧化(TMB_ox)，使溶液颜色由无色透明向蓝紫色转变，从而实现该硒单糖的灵敏指示。

技术领域

本发明涉及硒单糖的检出方法，尤其涉及一种硒单糖的酶催化检出方法。

背景技术

硒是人体必需的微量矿物质，硒缺乏所致“克山病”在我国北方和中西部偏远地区普遍发生；近现代临床医学进一步证实，人体硒含量与多种疾病相关分子(如心血管疾病的标志物-同型半胱氨酸)的代谢表达密切相关。因此，建立评价硒营养水平的生化指标极其必要。然而，根据已知的硒合成代谢，作为人血浆硒库的硒蛋白P结构保守性不佳并存在表达阈值，而其系列甲基化产物及硒取代含硫氨基酸在不同组织、细胞中的表达不一致且测量误差大，故都不适宜于作为健康监测的标志物。最新物种形成分析研究发现，人尿液中存在一种含量占绝对主导的硒排泄物，其学名为“1β-甲基硒-2-N-乙酰基-D-半乳糖胺”(1β-selenomethyl-2-N-acetyl-D-galactosamine，简称GalNAc1SeMe)，有望成为潜在的评估终点，这可为进一步阐明生物硒关联代谢提供有效的分析手段。1β-甲基硒-2-N-乙酰基-D-半乳糖胺对应的半缩醛结构如下：

目前，对特殊的硒掺杂化合物的检测一般采用高效液相色谱(或毛细管电泳)串联质谱这样的大型设备进行，这必然要求专人操作、测试周期较长，还须配制合适的流动相以实现特定组分的基线分离。另一方面，虽然凝集素lectin-DSA可识别细胞膜表面的蛋白糖基N-乙酰-D-半乳糖胺(简称GalNAc)，但也可与N-乙酰-D-葡糖胺(简称GlcNAc)识别，缺乏专一性；而筛选单糖多肽适配体的成本又极高，并且没有现成序列库可以借鉴，故都不适用于捕获游离的GalNAc单糖，更不用说这两类分子识体还需额外染料标记。所以，有必要为未来复杂生物试样中GalNAc1SeMe的快速、灵敏检出开发一种简易、温和而有效的分析手段。

最近，化学生物学家发现细菌的细胞色素P450单加氧酶(简称CYP450)在铁氧化还原蛋白(ferredoxin，简称FoX)、铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin reductase，简称FoR)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，即NADH)辅酶的联合帮助下，可被改用作甲氧基保护多糖(如6-O-methyl-D-galactose，6-O-甲基-D-半乳糖)的去甲基化酶(demethylase)。考虑到硒亦属于氧族元素，且硒甲基的共价键(l[CH₃-Se]＝198pm)长于甲基醚(l[CH₃-O]＝143pm)、前者键能更弱，因此可以尝试沿用类似的办法将其解离。但是如何利用上述反应检出硒单糖GalNAc1SeMe，目前人们还未开发出一种流程简单，检验效率高的检出方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种硒单糖的酶催化检出方法，本发明利用细胞色素P450单加氧酶对硒单糖中甲基硒官能团的识别，将该配基脱去，该过程伴随四甲基联苯胺的氧化，根据溶液颜色的转变实现硒单糖的灵敏指示。

本发明公开了细胞色素P450单加氧酶、铁氧化还原蛋白(FoX)、铁氧还蛋白还原酶(FoR)和还原型四甲基联苯胺(TMB_red)在检测硒单糖或制备硒单糖检出试剂中的应用，硒单糖为1β-甲基硒-2-N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc1SeMe)。