[发明专利]一种人脐带血间充质干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种人脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将脐带血单个核细胞用第一培养基培养至细胞生长状态稳定，后续改用第二培养基进行培养，其中，所述第一培养基主要由基础培养基、胎牛血清、抗生素和间充质干细胞生长添加物组成，其中胎牛血清体积占比为8-12％，间充质干细胞生长添加物体积占比为0.1-0.2％；所述第二培养基主要由基础培养基、胎牛血清、抗生素组成，其中胎牛血清体积占比为8-12％；所述基础培养基为DMEM/F12培养基；

所述脐带血取自早产儿；所述间充质干细胞生长添加物来自美国ScienCell公司；

所述生长状态稳定是用第一培养基对单个核细胞进行原代培养及传代培养至第2代，后续传代培养改用第二培养基；

所述原代培养包括用第一培养基将所述单个核细胞制成单细胞悬液，然后按细胞密度5×10⁶-2×10⁷个/mL将单个核细胞接种于细胞培养瓶中；

所述原代培养时，单个核细胞接种于细胞培养瓶后，2天后半量换液，5-7天后首次全量换液，以后每3-4天全量换液；

所述第一培养基、第二培养基中抗生素的含量为：100-120U/mL青霉素、100-120μg/mL链霉素和0.25-0.5μg/mL两性霉素B。

2.根据权利要求1所述的人脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述原代培养时，待细胞培养瓶中细胞融合度达到70～80％，进行传代培养。

3.根据权利要求1所述的人脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述细胞培养瓶用明胶进行包被处理。

4.根据权利要求1所述的人脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于，采用淋巴细胞分离液法分离出脐带血单个核细胞。

5.根据权利要求4所述的人脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于，单个核细胞分离的具体步骤为：

1)无菌条件下抽取新生儿的脐带血，肝素抗凝，得到肝素抗凝脐带血；

2)使用D-Hanks平衡盐溶液等比例稀释肝素抗凝脐带血；

3)将稀释肝素抗凝脐带血叠加到淋巴细胞分离液上得混合液，稀释肝素抗凝脐带血与淋巴细胞分离液的高度比为2:1；

4)将步骤3)所得的混合液以1500-2000r/min离心20-25min，吸取界面处的白色云雾层，用PBS平衡盐溶液1000-1500r/min离心、洗涤沉淀共2次。