[发明专利]一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用

权利要求书

1.一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体，其特征在于，所述pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体包括如SEQ IDNO:5所示的整个编码区序列okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro。

2.一种权利要求1所述的pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S11, 利用基因合成的方法，获得okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因的全长编码区序列；

S12, 将okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因构建到慢病毒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL上，得到质粒载体pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL。

3.一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S31，将1-2million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1毫升含有10wt%FBS的1640；

S32，再将30-35毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养5-6天后，再用2-4μg/ml的Puromycin进行选择性培养；所述慢病毒颗粒包含权利要求1所述的pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体；

S33，用流式检测okt3、CD64、CD86和4.1BBL这4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80%以上；

S34，再用100Gy的γ射线照射10分钟，-80℃冰箱进行冻存。

4.一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞，其特征在于，所述滋养细胞是通过权利要求3所述的方法制备得到的。

5.一种γδ T细胞的制备方法，特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的质粒载体包装慢病毒颗粒后，再将所述慢病毒颗粒侵染滋养细胞系，获得能够表达目的基因的滋养细胞，再利用滋养细胞在体外大量扩增γδ T细胞。

6.如权利要求5所述的γδ T细胞的制备方法，其特征在于，所述目的基因包括okt3、CD64、CD86和4.1BBL 中的至少一种；所述滋养细胞系包括肿瘤细胞；所述γδ T细胞为脐血γδ T细胞或外周血γδ T细胞。

7.如权利要求5或6所述的γδ T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的构建：

S2，用pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；

S3，K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备；

S4，获取脐血的白膜层细胞；

S5，脐血γδ T细胞的体外扩增。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括：

S21，重组慢病毒的包装制备；

S22，重组慢病毒的超速离心浓缩。