[发明专利]一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用

说明书

本发明涉及一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用，该制备方法包括：S1，pLenti‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL慢病毒质粒载体的构建；S2，用pLenti‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；S3，K562‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL滋养细胞的制备；S4，获取脐血的白膜层细胞；S5，脐血γδT细胞的体外扩增。本发明的制备方法利用okt3单链抗体通过CD8A跨膜区表达在滋养细胞膜上，尤其是能从脐血中低成本、快速、大量扩增γδT细胞，经过一个24天的扩增周期，γδT细胞的扩增倍数能达到10000倍左右，制备的γδT细胞纯度能达到90％以上。相较于用可溶的okt3抗体刺激，膜结合的okt3对γδT细胞扩增倍数在其2倍以上，具有良好的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及到一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用。

背景技术

根据T细胞受体，T细胞能分为两种，即αβT细胞和γδT细胞。在健康成人当中，γδT细胞在外周血中占T细胞的比例为3％到5％左右，而其中50％到75％是Vγ9Vδ2T细胞，而在脐血中，γδT细胞的含量更低，可能只有外周血的十分之一，因而在体外大量扩增脐血γδT细胞比较困难。γδT细胞介导的是一种先天性免疫，它不需要MHC分子的抗原提呈，在免疫监视和防范肿瘤发生起着重要的作用。它已经被发现浸润在肾癌、卵巢癌以及直肠癌等各种人类癌症组织中，它们能识别由转化细胞表达的压力相关抗原，发挥即刻的细胞毒作用以及分泌IFN和TNF等细胞因子。有文献都报道从肿瘤组织或外周血中分离的γδT细胞在体外对肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。另外，γδT细胞还能提呈抗原给CD8和CD4 T细胞，从而引发过继性抗肿瘤反应。Vγ9Vδ2T细胞能被磷酸化抗原IPP或者它的类似物BrHPP激活并增殖。

K562细胞为一种人慢性骨髓性白血病细胞系，经常通过基因修饰来作为抗原提呈细胞来支持免疫细胞的扩增。还有文献报道了通过表达膜结合的IL15和CD86以及CD137L的K562细胞来扩增外周血中的γδT细胞。

近年来，越来越多体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞被用于临床治疗，还有文献报道了对10名癌症患者进行了多轮Vγ9Vδ2T细胞回输治疗，结果6名患者获得了SD(疾病稳定)。还有文献报道了用体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞对一个晚期肝胆管癌的患者做了8个疗程的治疗，结果发现经过治疗后，患者的淋巴结肿瘤转移灶明显缩小，肿瘤标志物表达水平明显降低，整个治疗过程中没有发现明显的毒负作用。因而Vγ9Vδ2T细胞有着良好的临床应用前景。由于Vγ9Vδ2T细胞在脐血中的含量非常低，再加上来源于脐血的γδT细胞免疫原性很低，目前还没有文献报道一种可行的大规模扩增脐血γδT细胞的方法。

因而，目前亟需一种能够低成本快速大规模的扩增方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用，可提高脐血或外周血中Vγ9Vδ2T细胞的扩增效率，从而达到大规模生产用于临床肿瘤免疫治疗的Vγ9Vδ2T细胞的目的。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

依据本发明提出的一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体，所述pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体包括如SEQ IDNO:5所示的整个编码区序列okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

依据本发明提出的一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的制备方法，包括以下步骤：