[发明专利]一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法

权利要求书

1.一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法，其特征在于，表达ELP融合力学功能蛋白的发酵菌液预处理后经过镍亲和层析柱、除盐柱、SP离子交换层析柱纯化；

所述镍亲和层析柱纯化包括以下步骤：

（1）柱平衡：用20%乙醇洗涤Ni柱，之后用平衡缓冲液A进行平衡；

（2）上样：将预处理蛋白样品加载到平衡后的Ni柱中，流速控制在60 cm/h；

（3）平衡：用10 CV的平衡缓冲液A继续冲洗Ni柱，使未结合的组分从柱子上分离；

（4）洗脱：用总计10-15 CV体积的含有0-100%洗脱缓冲液A的平衡缓冲液A进行洗脱，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，收集洗脱液并保存；

所述除盐柱纯化包括以下步骤：

（1）柱平衡：用20%乙醇洗涤除盐柱，之后用平衡缓冲液B对除盐柱进行平衡；

（2）上样：取等于除盐柱体积20%-30%的经Ni亲和层析处理过的洗脱液，加载到除盐柱中，流速控制在60cm/h

（3）洗涤：用1.5-2CV的平衡缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液；

（4）除盐：再用3CV的平衡缓冲液B进行洗脱，去除除盐柱中残留的盐离子，弃置洗脱液；

（5）用从步骤（3）中得到的洗脱液重复步骤（2）-（4）直至样品全部脱盐，其电导值应等于平衡缓冲液B；

所述SP离子交换层析柱纯化包括以下步骤：

（1）柱平衡：用20%乙醇洗涤SP柱，之后用平衡缓冲液B对SP柱进行平衡；

（2）上样：将除盐后的样品用平衡缓冲液B稀释到适当的浓度，调整pH到8.0；

（3）平衡：用10 CV的平衡缓冲液B继续冲洗SP柱；

（4）洗杂：用5 CV洗杂缓冲液B冲洗SP柱；

（5）洗脱：用2 CV的洗脱缓冲液B洗涤SP柱，收集洗脱液并保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵菌液为ELP融合力学功能蛋白构建pET25b原核表达载体，转化E.coli BLR(DE3)大肠杆菌，经过诱导表达筛选获得的稳定表达菌株发酵获得的菌液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理为发酵菌液离心收集沉淀，洗涤后重悬，用高压破碎仪进行破碎，破碎后离心收集上清。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵菌液离心为8000 rpm离心20min；所述洗涤和重悬均采用平衡缓冲液A；所述高压破碎仪压力为39psi；所述破碎后离心为8000 rpm离心20 min；

所得上清液用0.45 μm滤膜进行过滤，除菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述镍亲和层析柱柱体积为500ml的Ni柱、所述除盐柱柱体积≥600ml、所述SP柱柱体积为85 ml 。

6.根据权利要求1~5任意一项所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液A为pH8.0的含有0.5 M NaCl、0.02 M咪唑的0.05 M磷酸钠缓冲液，洗脱缓冲液A为pH8.0的含有0.5 MNaCl、0.5M咪唑的0.05M磷酸钠缓冲液。

7.根据权利要求1~5任意一项所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液B为pH8.0的含有0.05M NaCl的 0.05M磷酸钠缓冲液，洗脱缓冲液B为pH8.0的含有2M NaCl的 0.05M磷酸钠缓冲液。